印度梨形孢的研究进展及其在农业生产上的应用前景

徐泽凌，陈复旦，毛碧增

(浙江大学生物技术研究所，浙江杭州 310058)

菌根是土壤中菌根真菌与高等植物的根系形成的一种共生体［1］，大部分陆生植物都与菌根真菌有着共生关系，真菌有利于生态系统中养分的循环，能够帮助植物从土壤中吸收营养物质，协助植物抵御不良环境的胁迫［2］。同时真菌可以利用植物光合作用的产物［3］，如丛枝菌根 (AM)真菌能够和甘蔗等80%的维管开花植物相互作用，加快植物生长，提高对病害等的抗性［4-6］。然而至今还未获得AM真菌纯培养，这在很大程度上限制了AM真菌分类学和生理学的发展［7］。

印度梨形孢 (Piriformospora indica)是一种类似于AM真菌的内生真菌，不同的是，印度梨形孢能够在人工培养基上培养［8］，且定殖范围比AM真菌更为广泛，无论在单子叶还是双子叶植物，甚至是苔藓植物上都能够定殖［3］。印度梨形孢的生物学功能已经明确，在促进植物生长、增强植物抗逆等方面都有显著作用。目前，国内外已有很多研究对印度梨形孢的作用机制进行探索。本文针对印度梨形孢与植物的互作机制及转化体系的研究现状进行总结，以期为印度梨形孢在农业生产中的应用提供参考。

1 印度梨形孢植物互作机制

印度梨形孢作为一种定殖范围广的有益真菌，在寄主植物根部定殖后，能引发一系列的生物学效应。目前研究发现，印度梨形孢的定殖主要会引起相关基因表达的改变、激素变化以及一些信号通路的改变等。

1.1 相关基因表达

Schuck等［9］研究发现，HSPRO(ORTHOLOG OF SUGAR BEET Hs1pro-1)基因在印度梨形孢和烟草的互作中起着重要作用，该基因表达的产物可促进早期幼苗的生长，平均比一般野生型植株增加30%的生物合成量。试验中发现，野生型烟草植株中检测不到HSPRO的转录产物，而定殖了印度梨形孢的植株中，该基因有着明显的表达。在拟南芥中，HSPRO1和HSPRO2会与SNF1依赖型的蛋白激酶 SnRK1中的 AKINβγ亚基相互作用，通过SnRK1控制其他基因的表达和调控相关酶的活力来调节代谢。同时，还有其他基因也被报道在印度梨形孢的定殖过程中其表达量会发生变化。例如，当印度梨形孢定殖于大麦根部的过程中，TLP基因被诱导，表达产生TLPs，TLPs能够在跨膜转运和囊泡运输中起作用，利于印度梨形孢的定殖［10］。

1.2 激素

研究报道，当piTam1基因被沉默之后，导致生长素的表达量有所减少，同时发现大麦根部印度梨形孢的定殖量也会随之减少，说明生长素可能是印度梨形孢定殖过程中的一个促进因子［11］。另外，乙烯在印度梨形孢的定殖过程中是必不可少的。印度梨形孢的定殖可分为两个阶段，首先是活体细胞阶段，之后伴随的是细胞致死阶段［11］。Khatabi等［12］研究发现，在第2个阶段，乙烯能够增强印度梨形孢在拟南芥根部的定殖，而损坏的乙烯信号通路会减少印度梨形孢的定殖。

1.3 信号传导

Qiang等［13］研究发现，在印度梨形孢定殖的细胞致死阶段，印度梨形孢首先抑制了内质网应激信号的传导，最后导致一种半胱天冬氨酶依赖型，以液泡为媒介的细胞死亡。不过，印度梨形孢只定殖于成熟根部的部分区域，并不进入根部的维管系统，因此并不会对根部的生长和功能造成影响。

除上述基因、激素和信号传导在印度梨形孢定殖过程中的作用之外，还有一些蛋白也起到了关键性的作用。比如，pii-2基因能编码一种富含亮氨酸的蛋白At5g16590，能够促进印度梨形孢和植物之间的识别，突变体则无法识别印度梨形孢［3］。

2 印度梨形孢遗传转化

印度梨形孢是一种多核丝状真菌，通过DAPI染色发现，每个细胞内含有2～10个细胞核不等［14］，印度梨形孢的遗传相当不稳定，大大增加了其转化难度。目前已有印度梨形孢转化的相关报道。

Zuccaro等［14］利用 PEG法成功将线性载体pvv26转入印度梨形孢中，2周后获得转化子，转化效率为2%。同时发现，质粒载体pBShhn-pTEF转化效率较低，约为1.5%。然而，在原生质体的制备方面，Zuccaro等［14］报道，利用木霉属溶壁酶未能获得印度梨形孢的原生质体，而课题组分别利用裂解酶、glucanex、溶壁酶和纤维素酶制备原生质体时发现，只有经溶壁酶处理后，才能获得符合转化要求、浓度为107个·mL-1的原生质体悬浮液，在这点上和Zuccaro等稍有不符。

Kumar等［15］利用更简便的电穿孔法也成功获得了转化菌株。电穿孔法是利用一个高压的电脉冲在细胞膜表面制造出一定量的亲水或疏水的微小通道，让 DNA通过扩散转入细胞膜内［16］。在12 500 V/cm的条件下，把含有RNAi结构的PiPT基因的质粒成功导入印度梨形孢中，这也是首次报道RNAi在印度梨形孢中的应用。

3 印度梨形孢在农业生产上的应用

印度梨形孢在植物生长中起重要作用，其一系列生物学功能已被证实，如能加快植物生长、促进植物营养物质的吸收和诱导植物产生抗逆性等。印度梨形孢在农业生产应用中有着广阔的前景。

3.1 加快植物生长

印度梨形孢是一种植物内生型真菌，在植物体内产生的最明显的生理效应就是促进植物生长，这一点已在多种植物中被证实。Fakhro等［17］研究发现，将印度梨形孢定殖于番茄的根部时，印度梨形孢有利于改善番茄的生长，使其叶的生物量增加20%;此外，在水培过程中研究发现，印度梨形孢能使番茄果实鲜重增加100%，干重增加20%。

Sun等［18］以中国卷心菜为试验材料研究发现，与印度梨形孢共培养15 d的卷心菜幼苗长势明显好于未经过共培养的对照组，根部鲜重增加38±5%，叶部鲜重增加46±6%。同时，主根和侧根的生长情况也有较大幅度的提升，叶片鲜重、根部鲜重、气孔数量等也有明显变化。在研究印度梨形孢和玉米的互作时，Kumar等［19］发现，在共培养45 d后，定殖有印度梨形孢的玉米植株干重相比于对照组可提高1.8倍。

印度梨形孢在大麦、小麦、拟南芥、烟草、玉米等植物上的促生作用也已得到验证。印度梨形孢对植物的促生能力一般在50%左右，但在很大程度上，由于试验条件和环境差异的影响，促生能力存在较大的不同［20］。

3.2 促进植物营养物质吸收

磷是植物生长过程中很重要的一种元素，但土壤中的磷很少以可溶性状态存在，因此很难被植物利用。植物吸收磷的主要方式有两种，一种是根部直接吸收，另一种就是依赖共生真菌的协助［21］。王凤让等［22］在研究印度梨形孢及其近似种Sebacina vermifera在番茄上的定殖，以及在不同磷水平下对番茄生长发育的影响时发现，在低磷条件下，接种印度梨形孢或S．vermifera的植株体内磷含量高于未接种的对照组，根系酸性磷酸酶活性显著低于未接种植株。说明印度梨形孢和S．vermifera能够促进番茄对磷的吸收，增加植株内磷的含量，提高植株对低磷逆境的抵抗能力。

除了磷元素，Sarma等［23］在研究印度梨形孢对西红柿生长的作用时发现，在印度梨形孢和荧光假单胞菌R81的作用下，西红柿植株在氮、磷、钾的吸收上分别能提高178%，102%和126%。

植物生物量的增加很大程度上依赖于植物对外界养分的吸收，印度梨形孢能够参与调节植物对土壤中磷和氮的吸收。试验表明，在拟南芥和番茄中，印度梨形孢能刺激NADH依赖的硝酸盐还原酶的活性，激活相关基因的表达［24］。因此，在作物的栽培中，可通过印度梨形孢和植物根部的互作来促进营养物质的吸收。但是，在印度梨形孢的定殖能增强硝酸还原酶的表达，同时也能促进对氮的吸收的观点上，Franken［20］认为，这里有一个问题还不清楚，是因为印度梨形孢定殖于植物根部促进植物生长，加强了对营养物质的吸收，还是因为通过加强对营养物质的吸收以促进植物的生长?因此这方面具体的机制还有待进一步的研究。

3.3 诱导植物抗逆

Sun等［18］研究表明，与印度梨形孢共培养的卷心菜在抗干旱方面强于非共培养的对照组，将共培养的试验组和空白对照组在相同的干旱环境下进行培养，4周后用PEG溶液处理，并于4 d后观察，发现对照组在PEG处理后受到严重的干旱胁迫影响，而试验组未表现出明显胁迫迹象。另外，陈佑源等［25］利用油菜研究发现，定殖印度梨形孢的油菜，其抗旱性能有显著的提高。分析表明，印度梨形孢提高油菜对干旱胁迫的抗性可能与MDA含量、质膜透性、Pro含量、抗氧化酶活性和干旱相关基因的表达有关。

Baltruschat等［26］以代谢活力、脂肪酸化合物、脂类过氧化物、抗坏血酸还原酶等为生理指标，对大麦中印度梨形孢介导的抗盐生化机制所做研究发现，印度梨形孢定殖的植株具有生长优势，同时弱化了盐敏感的大麦品种叶片中的NaCl诱导脂质过氧化作用、代谢能量外溢和叶片中的脂肪酸稀释等过程。

另外，印度梨形孢在抗病方面也有相关报道。Molitor等［27］发现，印度梨形孢定殖的大麦能对白粉病菌的感染产生抗性。在冬小麦的温室培养试验中，Serfling等［24］研究发现，印度梨形孢定殖的冬小麦能够显著降低镰刀菌、小麦基腐病菌、白粉病菌的侵染，但在外界低温环境下，印度梨形孢对叶部病菌侵染抑制效果不是很理想，和未接种印度梨形孢的对照组几乎无区别。

3.4 其他应用

除以上功能外，印度梨形孢还有其他一些作用。例如，在植物组培过程中，可利用印度梨形孢来炼苗。据Sahay等［28］报道，与印度梨形孢共培养的烟草组培苗在移栽至大田中时，存活率可达88%～94%，而未经过共培养的仅有62%。另外在与药用植物毛喉鞘蕊花的相互作用中，印度梨形孢不但能加快其生长，增加其产量，甚至还能使其次生代谢物发生变化［29］。

4 存在问题及展望

印度梨形孢定殖广泛且功能多样，具有促生、增产、抗逆等多种功能，相比于其他菌根真菌有着许多明显的优势。基于此，印度梨形孢越来越受到研究关注，但由于缺乏和寄主植物互作分子机制的认识，其应用受到限制［3］。同时，由于印度梨形孢遗传转化体系构建存在一定的难度，影响对印度梨形孢的进一步深入研究。另外，关于利用印度梨形孢来促进植物生长，增强其抗逆性是否会引起植物本身营养价值的改变的问题目前也尚未清晰。因此，这些方面都还需要进一步研究确定。此外，印度梨形孢并没有能够真正应用于大田中，只是停留在实验室摸索尝试阶段［30］，其利用价值有待进一步开发。

随着对印度梨形孢研究的不断深入，在阐明其作用机制的同时，可将其进行产业化生产，用于大田作物的栽培中，能有效促进作物生长，提高干旱、高盐地区作物的忍耐性，增强作物对病害等的抗性，提高作物产量;或将其研制成生物菌肥或生物基质，可用于贫瘠土壤的改良，能有效地减少化学肥料的使用，减轻由于化学肥料的使用而带来的环境污染［8］。随着研究的进一步深入，印度梨形孢的作用将会越来越显著，在可持续发展的农业生产中的地位也将会越来越突出。

［1］ 赵丽萍，许卉.菌根真菌接种提高植物抗盐能力的研究［J］.安徽农业科学，2007，35(1):22-23，25.

［2］ 王如岩，于水强，张金池，等.干旱胁迫下接种茵根真菌对滇柏和楸树幼苗根系的影响［J］.南京林业大学学报:自然科学版，2012，36(6):23-27.

［3］ Shahollari B，Vadassery J，Varma A，et al.A leucine-rich repeat protein is required for growth promotion and enhanced seed production mediated by the endophytic fungus Piriformospora indica in Arabidopsis thaliana ［J］.The Plant Journal，2007，50:1-13.

［4］ Varma A，Verma S，Sahay N，et al.Piriformospora indica，a cultivable plant-growth-promoting root endophyte ［J］.Applied and Environmental Microbiology，1999，65(6):2741-2744.

［5］ 李海燕，刘润进，束怀瑞.丛枝菌根真菌提高植物抗病性的作用机制［J］.菌物系统，2001，20(3):435-439.

［6］ 陈延速，李松，张金莲，等.丛枝菌根 (AM)真菌对甘蔗根系侵染研究 ［J］.西南农业学报，2011，24(5):1757-1760.

［7］ 钟凯，王淼焱，刘润进.AM真菌生活史、遗传特性与纯培养的生物学基础［J］.菌物学报，2009，28(2):310-314.

［8］ 楼兵干，孙超，蔡大广.印度梨形孢的多种功能及其应用前景 ［J］.植物保护学报，2007，34(6):653-656.

［9］ Schuck S，Camehl I，Gilardoni P A，et al.HSPRO controls early Nicotiana attenuata seedling growth during interaction with the fungus Piriformospora indica［J］.Plant Physiology，2012，160:929-943.

［10］ Reitz M U，Bissue J K，Zocher K，et al.The subcellular localization of tubby-like proteins and participation in stress signaling and root colonization by the mutualist Piriformospora indica［J］.Plant Physiology，2012，160:349-364.

［11］ Hilbert M，Voll L M，Ding Y，et al.Indole derivative production by the root endophyte Piriformospora indica is not required for growth promotion but for biotrophic colonization of barley roots ［J］.New Phytologist，2012，196:520-534.

［12］ Khatabi B， Molitor A， Lindermayr C， et al. Ethylene supports colonization of plant roots by the mutualistic fungus Piriformospora indica ［J］.PLoSONE，2012，7:1-8.

［13］ Qiang X，Zechmann B，Reitz M U，et al.The mutualistic fungus Piriformospora indica colonizes Arabidopsis roots by inducing an endoplasmic reticulum stress-triggered caspase-dependent cell death［J］.The Plant Cell，2012，24:794-809.

［14］ Zuccaro A，Basiewicz M，Zurawska M，et al.Karyotype analysis，genome organization，and stable genetic transformation of the root colonizing fungus Piriformospora indica ［J］.Fungal Genetics and Biology，2009(46):543-550.

［15］ Kumar M，Sharma R，Dua M，et al.“Electrotransformation”transformation system for root endophytic fungus Piriformospora indica［M］//Piriformospora indica. Springer Berlin Heidelberg，2013:309-321.

［16］ Weaver J C.Electroporation theory［M］ //Animal Cell Electroporation and Electrofusion Protocols.Humana Press，1995:3-28.

［17］ Fakhro A，Andrade-Linares D R，Bargen S，et al.Impact of Piriformospora indica on tomato growth and on interaction with fungal and viral pathogens ［J］.Mycorrhiza，2010，20:191-200.

［18］ Sun C，Johnson J M，Cai D，et al.Piriformospora indica confers drought tolerance in Chinese cabbage leaves by stimulating antioxidant enzymes，the expression of droughtrelated genes and the plastid-localized CAS protein ［J］.Journal of Plant Physiology，2010，167:1009-1017.

［19］ Kumar M，Yadav V，Tuteja N，et al.Antioxidant enzyme activities in maize plants colonized with Piriformospora indica［J］.Microbiology，2009，155:780-790.

［20］ Franken P.The plant strengthening root endophyte Piriformospora indica:potential application and the biology behind ［J］.Appllied Microbiology Biotechnology，2012，96:1455-1464.

［21］ Kumar M，Yadav V，Kumar H，et al.Piriformospora indica enhances plant growth by transferring phosphate ［J］.Plant Signaling ＆ Behavior，2011，6:723-725.

［22］ 王凤让，毛克克，李国钧，等.印度梨形孢及其近似种Sebacina vermifera促进番茄生长发育及磷吸收 ［J］.浙江大学学报:农业与生命科学版，2011，37(1):61-68.

［23］ Sarma M，Kuma1 V，Saharan K，et al.Application of inorganic carrier-based formulations of fluorescent pseudomonads and Piriformospora indica on tomato plants and evaluation of their efficacy ［J］.Journal of Applied Microbiology，2011，111:456-466.

［24］ Serfling A，Wirsel SG R，Lind V，et al.Performance of the biocontrol fungus Piriformospora indica on wheat under greenhouse and field conditions ［J］.Phytopathology，2007，97(4):523-531.

［25］ 陈佑源，楼兵干，高其康，等.印度梨形孢诱导油菜抗旱性机理的初步研究 ［J］.农业生物技术学报，2013，21(3):272-281.

［26］ Baltruschat H，Fodor J，Harrach B D，et al.Salt tolerance of barley induced by the root endophyte Piriformospora indica is associated with a strong increase in antioxidants［J］.New Phytologist，2008，180:501-510.

［27］ Molitor A，Zajic D，Voll L M，et al.Barley leaf transcriptome and metabolite analysis reveals new aspects of compatibility and Piriformospora indica-mediated systemic induced resistance to powdery mildew ［J］.Molecular Plant-Microbe Interactions，2011，24(12):1427-1439.

［28］ Sahay N S，Varma A.Piriformospora indica:a new biological hardening tool for micropropagated plants ［J］. FEMS Microbiology Letters，1999，181:297-302.

［29］ Das A，Kamal S，Shakil N A，et al.The root endophyte fungus Piriformospora indica leads to early flowering，higher biomass and altered secondary metabolites of the medicinal plant，Coleus forskohlii ［J］.Plant Signaling ＆ Behavior，2012，7(1):103-112.

［30］ 宋凤鸣，毛克克，吴铖铖，等.印度梨形孢的生物学效应及其作用机制 ［J］.浙江大学学报:农业与生命科学版，2011，37(1):1-6.