印度梨形孢对文心兰组培苗生长的影响

刘慧春，李明江，金亮，田丹青，朱开元，张加强，周江华，谭晨

(浙江省农业科学院 花卉研究开发中心，浙江 杭州 311202)

印度梨形孢真菌(Piriformosporaindica)首次发现于印度西北部的塔尔沙漠[1]，是一种可与植物共生的真菌，其典型特征是厚垣孢子为梨形[2]。依据该真菌的形态特征和其18S rRNA序列在Genebank中的比对结果可知，该真菌在分类上属于担子菌门伞菌纲蜡壳耳目蜡壳耳科梨形孢属。印度梨形孢与从枝菌根真菌在形态和生理特征上非常相似，均与植物共生，其最大差别在于，枝菌根真菌无法在人工合成的培养基上进行培养，而印度梨形孢可在人工培养基上继代繁殖[3]。

印度梨形孢可接种于多种植物根部，包括双子叶植物拟南芥、小白菜、油菜和单子叶植物大麦、水稻、玉米、文心兰等[4-10]。印度梨形孢与植物产生共生关系后，可以促进植物生长，增加植物生物量，植株抗氧化能力增强，并诱导植物产生系统抗性等[11-13]。此外有研究发现，大麦感染印度梨形孢真菌后，生长素合成、转运相关基因表达上调，印度梨形孢可能通过生长素的合成、运输调节植物地上部生长和根发育[14]。

本研究将印度梨形孢应用于观赏植物文心兰(Oncidiumorchid)中，建立了有效的印度梨形孢和文心兰的接种系统，发现印度梨形孢菌丝可以穿入文心兰根部的表皮层细胞，促进根部的生长和加粗，对文心兰地上部生长也有明显的促进作用。

1 材料方法

1.1 供试材料

供试材料为文心兰切花品种南西，生长于浙江省农业科学院花卉研究开发中心组培室中；供试印度梨形孢菌株由台湾大学叶开温教授惠赠。

1.2 培养方法

文心兰。在组培瓶中采用1/2MS培养基无菌培养文心兰小苗，待小苗高3～5 cm，有1～3个根时接入改良的G10培养基(1 L溶液中含有MS粉3.46 g，马铃薯200 g，琼脂10 g，蔗糖20 g，pH值5.7～5.8)培养2周。培养条件为20～28 ℃光照培养16 h，18～23 ℃黑暗培养8 h。

印度梨形孢。将印度梨形孢菌丝块接种于PDA培养基(1 L溶液中含有马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂 15 g)上，石蜡膜封口，28 ℃黑暗培养1周后备用。

共培养。将上述培养好的印度梨形孢菌块接种于文心兰组培瓶中，距离文心兰根部0.5～2 cm，培养条件为20～28 ℃光照培养16 h，18～23 ℃黑暗培养8 h。

共培养20 d左右更换培养基进行继代培养，继代培养中不需要再加入菌块，文心兰根部携带的真菌可作为菌种进行共培养。

1.3 石蜡切片观察

根解剖结构的观察参照李正理[15]石蜡切片法。

2 结果与分析

2.1 共培养体系的建立

供试材料文心兰切花品种南西的组织培养生根小苗所用培养基为1/2MS，印度梨形孢继代培养基为PDA培养基。通过前期试验发现，将印度梨形孢接入1/2MS后，真菌生长缓慢，培养5 d后仍未见明显生长。为建立印度梨形孢与文心兰的共培养体系，对文心兰所用1/2MS培养基进行改良，加入马铃薯汁形成G10培养基，观察文心兰和真菌在此培养基上的生长。结果表明，文心兰在G10培养基上生长发育正常；印度梨形孢在G10培养基上生长良好，生长速度与在PDA培养基上接近，菌丝和孢子均生长正常(图1)。

把文心兰组织培养小苗接入G10培养基，生长约2周后，用印度梨形孢菌丝块接种文心兰小苗，菌块放置于根部约0.5 cm处，进行真菌和幼苗的共培养。约20 d后，印度梨形孢真菌可长满整个培养基。此时观察发现，共培养的文心兰植株开始萌发新的气生根，且比侵染前的根要粗壮。为避免菌丝的过量生长对植物生长带来抑制，在共培养20 d后，将共培养和对照植株均接入新的G10培养基进行继代培养，继代培养的植株不再接入新的菌块，根部携带的真菌可在20 d左右铺满新的培养基，达到共培养的目的。

2.2 印度梨形孢对文心兰根部的侵染

为检测印度梨形孢对文心兰根部的侵染状况，对印度梨形孢共培养植株的根做了石蜡切片。显微镜下观察发现，印度梨形孢可定殖于文心兰的根部。从图2可以看出，印度梨形孢菌丝可以成功侵入文心兰根部的表皮层，并在表皮细胞内部延伸扩展。从图3可以看出，印度梨形孢的侵染和在根部的定殖造成了文心兰根部表皮层细胞的膨大，由于这层细胞的膨大造成了共培养植株根的加粗。

图1 印度梨形孢在G10和PDA培养基上培养5 d后的生长状况

RC，表皮层。20×、40×、100×代表显微镜不同倍数；CC，维管柱；C，皮层；RC，表皮层图2 印度梨形孢菌丝对植株根部表皮层的侵染状况

CC，维管柱；C，皮层；RC，表皮层图3 印度梨形孢共培养植株和对照植株的根纵切面比较

2.3 印度梨形孢对文心兰的促生作用

共培养50 d后，将对照植株和共培养植株出瓶，对共培养植株和对照植株的生物量进行观察和测定。从图4可以看出，印度梨形孢共培养对文心兰植株的生长有明显的促进作用，株高、根的数量上明显高于对照；从表1可以看出，共培养植株的株高比对照增加70%左右，鲜重增加96%左右。共培养植株的根的数量明显增加，根总长度是对照的2.4倍。

图4 印度梨形孢共培养植株的表型观察

表1 印度梨形孢共培养植株的生长促进状况

3 讨论

真菌培养常用的培养基有PDA、CZA等，植物组织培养多用MS、1/2MS培养基，不同培养基的分离真菌效果不同[16-17]。在本研究中，印度梨形孢真菌在1/2MS培养基中生长缓慢，但在加有土豆的G10培养基中，其生长就能像在PDA真菌培养基中一样正常。这可能源于印度梨形孢是寄生菌，需要从寄主植物吸收营养元素才能更好地生长，加有土豆的培养基刚好可以提供印度梨形孢所需的营养元素。1/2MS培养基中主要成分是碳源和糖，不能有效供给印度梨形孢所需的营养需求，所以生长缓慢。

本研究发现，印度梨形孢可很好地与文心兰共生，其菌丝定殖在文心兰根部表皮层，并通过表皮细胞的扩增使得根部加粗，这一现象非常符合印度梨形孢的特性，即印度梨形孢与植物共生后菌丝仅在根系表面、根系表皮细胞之间和根系表皮细胞内部扩展[18]。据报道，印度梨形孢不仅能够与多数植物共生[19]，而且还能促进植物的生长发育，这可能与赤霉素有关[10,14]。印度梨形孢定殖于寄主植物根部，通过分泌生长素来促进植物根系生长，从而加快根系对营养物质的吸收，最终达到对寄主植物的促生作用[20-25]。由此推测，印度梨形孢对文心兰的促生作用，与印度梨形孢感染文心兰后提高了寄主植物根系赤霉素的含量有关。

综上所述，印度梨形孢可与文心兰共生，菌丝定殖于文心兰根部表皮层，能提高根系的数量和长度，促进文心兰植株地上部分的生长。后续有待进一步研究印度梨形孢对文心兰的促生、抗逆作用，并有望将印度梨形孢应用于文心兰组培苗炼苗、种苗繁育、栽培、育种等方面。