胰岛β细胞发育与再生的研究进展*

蒋旭超，　谢志芳，　章卫平△

(第二军医大学 1病理生理学教研室， 2肥胖与糖尿病研究中心，上海 200433)

糖尿病是当今严重危害人类健康和社会发展的重大疾病之一，在全球不同国家和地区的发病率均呈现不断上升和年轻化的趋势。2010年中国糖尿病患者近9 200万[1]，目前全球糖尿病患者已增至3.66亿人，根据预测，20年内将达到近6亿人，全球每年死于糖尿病的人数约为460万，用于糖尿病患者的医疗开支共计4 650亿美元。因此，糖尿病的防治任重道远。糖尿病主要分为1型和2型，共同的病理生理学特征是胰岛β细胞数目减少和(或)功能障碍。因此，胰岛β细胞的发育与再生一直是糖尿病领域的研究前沿和热点，该方面的研究进展可能为糖尿病的防治带来新的突破。本文就胰岛β细胞发育与再生的最新研究进展做一综述。

1　胰岛β细胞的发育

1.1胰腺的组成胰腺由外分泌部和内分泌部构成。外分泌部由腺泡细胞和导管细胞构成。胰腺内分泌部主要由散在胰腺各部的胰岛和在胰腺外分泌细胞中的内分泌细胞构成。胰岛是胰腺的主要内分泌组织，主要有5种类型的细胞，即α、β、δ、PP和ε细胞，分别分泌胰高血糖素、胰岛素、生长抑素、胰多肽和生长激素释放肽。其中α细胞约占胰岛细胞的15%～20%，β细胞占70%～80%，δ细胞占5%，PP 细胞占1%，ε细胞﹤1%。在多数哺乳类动物中，内分泌细胞在胰岛内的分布相似，其特点是β细胞位于核心，而周围由非β细胞(α细胞和δ细胞)构成非连续性框架。人类和灵长类的胰岛形状及排列更加复杂，轮廓有椭圆形和三叶草形等多种形态。

1.2胰腺内分泌细胞的分化人体内分泌细胞来源于导管样上皮细胞，于孕第7周开始分化；第12周时，胰岛细胞增多并离开导管上皮迁移到导管旁的间充质内聚集，形成原始胰岛；第14周时，胰腺间充质大量增生，分隔胰腺组织形成胰腺小叶，胰岛形成并继续保持高速增殖分化直到出生。出生后，胰岛经历了β细胞复制、增生及凋亡的重塑过程。出生阶段，β细胞群体中每天约有18% β细胞进行复制增殖，使β细胞数量增多，以适应合成胰岛素的需要。成年后，β细胞的复制率占总数的2%～3%。胰岛通过凋亡和增殖的平衡来维持β细胞数量的稳定[2]。

2　胰岛β细胞分化的分子机制

研究证明，参与胰岛β细胞分化的转录因子主要包括胰十二指肠同源异型盒蛋白1(pancreatic duodenal homeobox 1，Pdx1)、神经元素3(neurogenin 3，Ngn3)、激活素A(activin A)、配对盒基因4(paired homeobox gene 4,Pax4)、NK2转录因子相关的基因座2(NK2 transcription factor related, locus 2,Nkx2.2)及NK6转录因子相关的基因座1(NK6 transcription factor related, locus 1,Nkx6.1)等，这些蛋白协调表达决定了胰岛β细胞的分化。

2.1Pdx1Cerf等[3]研究认为Pdx1是表达于早期胰腺发育、胰岛细胞分化和β细胞成熟过程中的一个重要的转录因子。Pdx1诱导内胚层向胰腺定向发育和成熟, 其活化可促进胰岛素、生长抑素、葡萄糖激酶、葡萄糖转运子2和胰岛淀粉样多肽等β细胞重要基因的表达，并可诱导内源性生长激素抑制激素基因的表达，是胰腺开始形成的标志；促进胰岛素分泌和维持胰岛β细胞的正常功能, 其对出现在肠内胚层背侧及腹侧的胰腺萌芽的生长分化起重要作用，其纯合子缺失突变会导致胰腺无法形成[2]。

2.2Ngn3Ngn3是碱性螺旋-环-螺旋家族转录因子，属于胰岛祖细胞的特异性表达基因之一，在胚胎内脏内胚层新生内分泌胰腺中起重要作用[4]。上调其下游基因神经源性分化因子1(neurogenic diffe-rentiation factor 1,NeuroD1)表达，Pax4/6等可促进胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide 1,GLP-1)对β细胞的分化作用。Melton实验室利用重组腺病毒将Ngn3、Pdx1及肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A基因 (v-mafmusculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene ho-molog A,MafA)联合作用可在体内不需要重新编程即可将外分泌腺的胰腺泡细胞转分化成β细胞[5]。此外，Ngn3对本身的表达具有负调控作用，当Ngn3通过激活胰岛素细胞转录因子促进胰岛细胞分化时，Ngn3也抑制本身基因的表达[6]。

2.3Activin AActivin A属于TGF-β超家族成员。不同浓度的activin A可使胚胎干细胞向不同胚层细胞分化[7]。Activin A在胚胎干细胞向胰岛素生成细胞分化的过程中起着重要的调节作用。Kitamura等[8]发现，一种植物碱药物conophylline(CnP)和β细胞素δ4(betacellulin-δ4,BTCδ4)可以使β细胞分化，二者比用activin A和β细胞素(betacellulin)更能有效诱导胰岛β细胞的产生，且分化成的β细胞更能应答高血糖刺激，说明CnP是一种比activin A更为有效的诱导胰岛细胞生成的因子。

2.4Pax4Pax4是成对-同源框基因家族成员，在胰腺早期分化及成熟胰岛细胞增殖过程中起重要的作用。早期在胚胎胰芽中表达，晚期局限于分化的β细胞中，胰腺发育成熟后，不再表达[9]。Pax4对胰岛素和生长抑素产生细胞分化是必要的, 促进β和δ细胞的发育。

2.5Nkx2.2与Nkx6.1Nkx2.2和Nkx6.1是NK2型同源盒基因家族成员。Nkx2.2在腹侧中枢神经系统和胰腺中表达。Nkx2.2从胚胎胰腺8.5 d即在腹侧和背侧胰芽中表达。胰岛发育完全后，在除δ细胞外的所有胰岛细胞中表达，它对于表达胰岛素是必需的[10]。Nkx2.2是下游的调控因子，保证定向分化形成的内分泌细胞具有内分泌作用。Nkx2.2是β细胞分化的重要调节因子，对于β细胞的最终分化是必要的。Nkx6.1位于Nkx2.2下游，是一个特异表达于成熟β细胞的转录因子。最早于胚胎9.0～9.5 d在胰腺导管上皮细胞中表达，后来特异局限于成熟的β细胞，Nkx6.1在β细胞分化过程中发挥重要作用。

3　胰岛β细胞的变化与糖尿病的关系

糖尿病是一种以血浆葡萄糖水平升高为基本特征的代谢性疾病。1型糖尿病患者因免疫损伤、β细胞数量进行性丧失及胰岛素分泌不足导致血糖持续升高。2型糖尿病患者同时存在胰岛素分泌缺陷和胰岛素抵抗，存在β细胞数量的丢失或功能不足，致胰岛素总量不足或生物效应的降低，引起血糖升高[11]。不论是1型还是2型糖尿病，最终在多因素损害下均会导致β细胞衰竭，β细胞的分泌缺陷和数量缺失可导致胰岛素供给缺乏，机体代谢障碍。糖尿病早期，β细胞功能损害尚部分可逆，但到了晚期，由于胰岛数量和β细胞总量减少，功能衰退发展为不可逆[12]。因此，早期消除或减轻各种损害β细胞的因素，逆转其衰竭，晚期增加β细胞数量和提升其质量是解决糖尿病损害的关键途径之一。

现有证据表明，β细胞群是不断变化的，通过β细胞功能和大小数量的变化使血糖浓度局限在一个很狭窄的生理范围内[3]。β细胞群大小数量的增加或减少可能与β细胞数量(增殖或凋亡)和单个细胞体积(肥大或萎缩)的变化有关。在肥胖、妊娠等情况下，胰岛细胞的数量和胰岛的体积都明显增加，妊娠大鼠的β细胞数量比正常时增加50%。胰岛素受体或胰岛素受体底物1基因敲除的小鼠，其血浆胰岛素水平比正常小鼠高数十倍。同时，其β细胞的数量约是正常小鼠的数十倍[13]。这种细胞数量的增加是一种有效的功能代偿形式，其机制可能包括β细胞的增生增加、凋亡减少和胰岛的再生。

4　胰岛β细胞再生的细胞来源

4.1成熟β细胞Dor等[14]发现在正常的生理或胰腺部分切除后(70%)，新的β细胞是由已经存在的成熟β细胞复制或有丝分裂形成的，并不是由其干细胞或者祖细胞分化发育而来。从而直接证明终末分化的小鼠β细胞仍具有增殖能力。β细胞的复制主要是在胰岛内部，胰岛的体积会随着β细胞复制而增加，并没有新的胰岛生成。Spijker等[15]发现成熟内分泌细胞的可塑性能够被调控。在没有引入基因突变修饰的情况下，初始人类β细胞经历了一个转变过程而成为产生胰高血糖素的α细胞。慢病毒介导的β细胞谱系跟踪揭示，这个转变过程在几天内发生。在超微结构形态的基础上，已转化的细胞与原始α细胞难以区分，且移植体内后能维持α细胞的表型。随着β细胞脱颗粒和产生胰高血糖素细胞内β细胞特异性转录因子Pdx1及Nkx6.1的表达，β细胞转变成α细胞。

4.2胰岛α细胞Thorel等[16]使用白喉毒素(diphtheria toxin,DT)将RIP-DTR小鼠的胰岛β细胞几乎全部破坏，诱发糖尿病，并采用遗传谱系追踪标记监测方法在6个月后发现胰岛β细胞再生，数量增加，并且是由α细胞转化而来。Maria-Engler等[13]也发现胰岛α细胞可以向β细胞转化，其中Pdx1、Nkx6.1和Pax4起了关键作用，并且胰岛α细胞和β细胞有共同的转录因子(如Isl1和Pax6)和起源。Talchai等[17]发现在2型糖尿病β细胞功能衰竭的过程中，β细胞去分化转变为α细胞是其中的重要机制。这些研究结果表明，胰岛α细胞和β细胞在特定的病理生理条件下，可能存在交互转分化过程。

4.3胰腺导管前体细胞胰腺导管细胞可能是胰岛的前体细胞。采用共聚焦显微和微量RT-PCR方法证实，长期培养巢蛋白阳性的胰岛细胞，可被视为前体细胞分化为完全功能β细胞的潜在来源[18]。Phinney等[19]在体外定向诱导成人胰腺导管细胞分化为分泌胰岛素的功能性胰岛细胞团。Bonner-Weir等[20]从人胰腺导管中诱导分化出有组织结构的胰岛样细胞团(cultured human islet buds,CHIBs)，CHIBs可根据葡萄糖刺激产生胰岛素分泌。

4.4胰腺腺泡细胞Furuya等[21]发现，配体结合的甲状腺激素受体α(thyroid hormone receptor α,TRα)在β细胞数量的后天扩增生长过程中起着关键作用。使用能表达TRα的腺病毒载体去诱导腺泡细胞的重新编码而使其转变成产生胰岛素的细胞，其中TRα是由淀粉酶2启动子(AdAmy2TRα)调控的。用3,5,3′-三碘甲状腺原氨酸的治疗增加了TRα与磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)亚基p85α的联系，在纯化的腺泡细胞中，磷酸化丝/苏氨酸激酶(serine/threonine kinase,Akt)致其活化，从而促进Pdx1、Ngn3和MafA表达。基于凝集素相关细胞谱系示踪系统和Cre/loxP位点细胞谱系示踪系统的分析，表明新合成的产生胰岛素的细胞来源于胰腺腺泡细胞。经电子显微镜观察到细胞中含有胰岛素的分泌颗粒。由小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)介导的p85α沉默或由LY294002诱导的PI3K抑制，揭示了的Pdx1、Ngn3和MafA的表达和产生胰岛素细胞的重新编码。

4.5胚胎干细胞Schuldiner等[22]发现，胚胎干细胞可以在体外自发分化为能够产生胰岛素的细胞，但效率非常低(1%～2%)。Segev等[23]应用H9.2胚胎干细胞系在体外经过6个不同阶段的分化，形成了胰岛样细胞团。Kroon等[24]发现，胚胎干细胞成熟时可生成一种相应于胰腺内胚层的细胞，其能够保持血糖接近正常水平，但得到的内分泌细胞会有一些不成熟的表型，可能形成畸胎瘤。因所获得胰岛样细胞分泌胰岛素水平低，远远达不到β细胞的功能，以及伦理学问题等限制了胚胎干细胞的应用。

4.6骨髓间充质干细胞人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)是来源于中胚层的具有自我更新和分化潜能的多能干细胞，能够向胰岛样细胞分化，促进受体残余胰岛增殖。Moriscot等[25]发现hBMSCs能够分化为胰岛素分泌细胞，经RT-PCR检测肝核转录因子叉头盒蛋白A2(forkhead box protein A2,FoxA2)和胰岛素启动因子1在诱导其分化过程中起重要作用。唐小龙等[26]研究发现Pdx1联合Nkx6.1促进骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞。Sun等[27]研究证实，即使是糖尿病患者的hBMSCs，也可以在体外诱导成胰岛素生成细胞，自体移植后可有效避免排斥反应，这种hBMSCs表达CD29、CD44和CD106。

4.7脐带血干细胞脐带血所含淋巴细胞的免疫功能不够成熟，体内移植能逃避主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)不相容的免疫细胞攻击。研究证实，脐血中除了富含造血干细胞，还含有多潜能干细胞-间充质干细胞。Michael等[28]经外周静脉为15位1型糖尿病患儿实施脐血自体移植术，移植后患儿内源性胰岛素分泌衰退的速度减慢，没有明显不良反应。苏仲春等[29]使用细胞外基质胶将人脐血间充质干细胞在体外培养分化为胰岛素分泌细胞，可见细胞团样结构，胰岛素阳性细胞占所诱导细胞的(25.2±3.4)%，诱导后的细胞表达胰岛相关基因和激素。

4.8脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)脂肪组织来源方便，且含有大量的间充质干细胞。Chandra等[30]采用分步诱导法，将ADSCs诱导成能分泌胰岛素的胰岛样细胞。印度学者用ADSCs结合骨髓移植治疗了5例1型糖尿病患者，发现患者胰岛素的需求降低，血液C-肽水平提高了4～26倍，且平均维持在3个月左右。研究表明用人的ADSCs结合骨髓移植治疗1型糖尿病比较安全，没有出现明显的排斥反应，也避免了异基因的污染[31]。

4.9诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS细胞)2006年，Takahashi等[32]向鼠胚或成体成纤维细胞中导入4个特定的转录因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc及Klf4)产生出iPS细胞。经过筛选，发现了具有干细胞形态的细胞群落和具有胚胎干细胞特异的表面抗原，通过检测充分证明了它们具有多能性。2009年，“小小”的诞生再次证明了iPS细胞的全能性[33]。Zhang等[34]将iPS细胞诱导分化为成熟的产胰岛素细胞，大部分表达与成熟β细胞相同的特异标记，如Nkx6.1和Pdx1。2010年7月，Seki等[35]研究发现T细胞诱导性多能干细胞(T-cellderived iPS cells,TiPS cells) 保留了T淋巴细胞受体的基因组重排，并且其受体基因座重排可作为一种基因签名用于体内示踪。iPS细胞具有许多独特的优点，如来源不受限制，避免了免疫排斥反应以及伦理道德等问题，保证了其具有广泛的应用前景，然而致瘤性是其致命的缺陷，安全性、有效性仍需进一步验证。

5　展望

目前关于通过胰腺成熟细胞、干细胞等来源定向分化为β细胞的多种途径的研究已经取得了一定的成果，从而有希望在根本上解决β细胞来源不足的问题，为临床纠正糖尿病患者的β细胞功能缺陷提供有效手段。但如何解决定向诱导产生大量的功能性β细胞，克服排斥反应，避免自身免疫反应的攻击以及干细胞致瘤性等问题仍是一个巨大挑战。随着干细胞生物学的发展，相信将来肯定能克服以上困难，掌握一套成熟的技术用于临床治疗攻克糖尿病。

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