病炎清颗粒抗甲型流感病毒的体外实验*

乔秋杰 曲敬来 高 雪 张 忠

（广东省深圳市中医院，广东 深圳 518033）

病炎清颗粒是本课题组20 余年的中医疫病临床经验方，其采用有效而且具有独特抗流感病毒作用的中草药配制而成。本实验采用MDCK 细胞培养法，观察病炎清颗粒体外抗甲型流感病毒的抑制作用，并与对照组清开灵注射液、病毒唑进行比较，探讨其对甲型流感病毒感染的治疗作用及可能的作用途径。

1 材料与方法

1.1 药物 病炎清颗粒：连翘30 g，马勃30 g，桔梗12 g，牛蒡子20 g，柴胡20 g，黄芩12 g，僵蚕10 g，薄荷12 g，白前12 g，百部12 g，荆芥12 g，莪术10 g，甘草10 g。以上药物共202 g，加入温开水稀释成202 mL，相当于每mL 所含生药1 g。清开灵注射液，广州白云山明兴制药有限公司，批准文号：国药准字Z44022855。病毒唑（三氮唑核苷RIBAVIRIN），浙江康裕药业有限公司产品，批号：960501。

1.2 病毒株及细胞株 病毒株：流感病毒甲型A/粤防/243/72（H1N1），中国医科院生物技术研究所提供。细胞株：狗肾传代细胞（MDCK），中国医科院生物技术研究所提供。细胞培养液：含10%新生小牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL的链霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM 培养液（中国医科院生物技术研究所提供）。细胞维持液除所含小牛血清为2%外，其他含量均同细胞培养液。

1.3 药物处理 病炎清颗粒、清开灵注射液的第一浓度为药物母液稀释3 倍，再用培养液作2 倍系列稀释，共8个稀释度。稀释度分别为1∶3、1∶6、1∶12、1∶24、1∶48、1∶96、1∶192、1∶384。

1.4 药物对MDCK 细胞的毒性试验 将MDCK 细胞接种于96 孔培养板，置37℃、5% CO2培养24 h 后，形成细胞单层。加入用细胞维持液稀释的不同浓度待测药物（稀释度见上），37℃、5% CO2继续培养72 h，显微镜观察细胞形态，并用噻唑蓝（MTT）比色法在590 nm 波长处测定吸光度A 值，按如下式计算细胞存活率，确定药物的半数毒性浓度（TD50）和最大无毒浓度（TD0）。每个剂量药物加入4 孔，同时设正常细胞对照和空白组。细胞存活率（%）=（实验孔A 值／对照孔A值）×100%

1.5 测试方法 MDCK 细胞种96 孔培养板，24 h 后感染甲型流感病毒，吸附2 h，弃病毒液。加入以上稀释度的药物，同时设细胞对照孔和病毒对照孔，观察24 h细胞病变程度（CPE），用Reed～Muench 法分别计算药物对甲型流感病毒的半数抑制浓度（IC50）。并计算选择指数（SI＝TD50/IC50）。细胞病变程度表示法：“-”为细胞生长正常，无病变出现；“+”为细胞病变占整个单层细胞的25%以下；“++”为细胞病变占整个单层细胞的50%以下；“+++”为细胞病变占整个单层细胞的75%以下；“++++”为细胞病变占整个单层细胞的75%以上。

2 结果

本实验各项操作均按病毒学实验常规进行［1］。结果表明：病炎清颗粒在1∶24（相当于生药41.67 mg/mL）稀释度时达到TD50，在1∶48（相当于生药20.83 mg/mL）稀释度时达到TD0，在1∶96（相当于生药10.42 mg/mL）稀释度时达到IC50，选择指数SI＝4.0。而清开灵注射液在1∶19.4 稀释度时达到TD50，在1∶35.2 稀释度时达到TD0；在1∶49.1 稀释度时达到IC50，选择指数SI＝2.53。病毒唑对甲型流感病毒的半数抑制浓度IC50＝5.91 μg/mL。结果提示，病炎清颗粒对流感病毒甲型所致的细胞病变有一定的抑制作用，优于中药对照组，与西药对照组相近。

病炎清颗粒在1∶24时相当于生药41.67 mg/mL，在1∶48时相当于生药20.83 mg/mL，在1∶96 相当于生药10.42 mg/mL。

3 讨论

中药抗流感病毒基本原理是扶正祛邪或祛邪扶正。国内外对中药抗流感病毒有效部位或成分的筛选研究表明［2］：中药抗流感病毒主要有直接灭活或抑制病毒和通过诱生干扰素或调节人体免疫功能而间接抑制病毒两种方式。现有的研究也表明［3］，中药复方具有抑制流感病毒复制、阻止流感病毒致细胞病变、调节免疫功能、改善肺循环、镇痛抗炎等综合作用，使流感痊愈。

病炎清颗粒是本课题组多年的疫病经验方，本实验采用MDCK 细胞培养法进行病炎清颗粒抗甲型流感病毒的体外实验，证实其在体外具有较强的抗甲型流感病毒的作用，且毒副作用小、安全性高；综合实验结果，病炎清颗粒抗甲型流感病毒的作用机理可能为既调节人体免疫功能而间接抑制病毒，又抑制病毒在细胞内部的复制增殖。但由于单味中药成分复杂不清，复方中药又涉及单味中药之间的相互作用，因此对于具有多组分、多种作用途径的中药来说，其抗流感病毒机理也相对复杂，尚有待于进一步深入研究。

［1］中国医学科学院流行病研究所.常见病毒病实验技术［M］.北京：科学出版社，1987：213.

［2］冯书晓，陈文，冯俊阳，等.抗流感病毒植物药有效部位筛选研究概括［J］.中国中医药信息杂志，2005，12（11）：101.

［3］胡旭，邱全瑛，姜良铎.中医药抗呼吸道流感病毒感染实验研究概括［J］.中国中医药信息杂志，2004，11（2）：180.