乙酰化白藜芦醇通过调节缝隙连接蛋白43表达减轻海水淹溺型急性肺损伤

马李杰 李艳燕 赵诣林 刘雪英谢永宏 梁 力 南岩东 穆德广李王平 金发光

2710032 陕西西安，第四军医大学药学系药物化学教研室

马李杰，李艳燕，赵诣林，等.乙酰化白藜芦醇通过调节缝隙连接蛋白43表达减轻海水淹溺型急性肺损伤［J/CD］.中华肺部疾病杂志:电子版，2013，6(1):15-19.

淹溺是普遍的公共卫生和健康问题，每年造成 大量人员伤亡，并且受害者多为儿童和青少年。淹溺除导致受害者直接死亡外，也能导致急性肺损伤(acute lung injury，ALI)，如不及时治疗或治疗不当可发展为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)［1］。淹溺导致肺损伤的严重程度与进入肺的水量和水的清洁程度有关。目前研究表明，海水吸入导致的肺损伤明显比淡水严重［2］，海水能够引起肺部明显的水肿和炎症反应。另外，有研究表明，肺部炎症的发生、发展和扩散与细胞间的缝隙连接和细胞间通讯功能密切相关［3］。

缝隙连接蛋白(connexin，Cx)是细胞间直接相连并构成细胞间缝隙连接的一类膜蛋白。每六个哑铃形的连接蛋白亚单位可形成连接子，在连接子的中央存在一个亲水性的通道，允许分子量小于1.5 ×103的小分子如，Ca2+、cAMP、cGMP、氨基酸、葡萄糖、核苷酸、维生素等物质通过，进而形成细胞间的通讯功能 (gapjunctionintercellular communication，GJIC)［4］。肺泡上皮细胞表达的 Cx有Cx26、Cx32、Cx43，内皮细胞表达的主要有Cx37、Cx40、Cx43。Cx43是肺泡细胞表达的最主要的Cx，调控对急性肺损伤至关重要的Ca2+信号通路，是肺部炎症反应的基础［5］。

乙酰化白藜芦醇(3，5，4＇-tri-O-acetylresveratrol)是白藜芦醇 (resveratrol)的前药，在体内代谢为白藜芦醇发挥药理活性，后者具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗衰老和心脑血管保护等多种生物学和药理学活性，近年来备受关注［6-7］。本研究通过复制大鼠海水淹溺致急性肺损伤(seawater drowning induced acute lung injury，SWD/ALI)模型，观察乙酰化白藜芦醇的治疗作用，并探讨Cx43参与其中的相关机制。

材料与方法

一、实验试剂

乙酰化白藜芦醇由第四军医大学化学教研室合成提供，高效液相 (highperformanceliquid chromatography，HPLC)检测纯度达到99%以上，用5‰羧甲基纤维素钠(cardoxymethyl cellulose sodium，CMCNa)溶液制成混悬液灌胃给药。海水配方由中国国家海洋局第三海洋研究所海洋生化研究室提供，渗透压1250 ～1350 mmol/L，pH 8.20，密度1.05～1.06 g/L。Cx43 和 β-actin 单克隆抗体购于安博生物技术有限公司。TNF-α和IL-10 ELISA试剂盒购于R＆D公司。其他试剂均为国产或进口分析纯。

二、实验动物及分组

健康雄性SD大鼠，清洁级，体质量220 g左右，由第四军医大学实验动物中心提供。采用完全随机的方法将实验大鼠分为四组:A:空白对照组，B:海水淹溺组，C:乙酰化白藜芦醇预处理组和D:乙酰化白藜芦醇组，每组8只。从造模前7 d开始，各组大鼠分别灌胃:A和B组:生理盐水;C和D组:乙酰化白藜芦醇150 mg/kg。第七次灌胃90 min后，A和D组大鼠放血处死。B和C组大鼠制做海水淹溺型急性肺损伤模型，造模4 h后放血处死收集取肺组织标本。

三、检测指标及方法

1.肺组织病理学检查:取各组大鼠相同部位肺组织标本用4%多聚甲醛固定24 h，常规石蜡包埋、切片，HE染色观察肺组织结构变化。

2.肺组织湿干比(W/D)测定:取每只大鼠相同部位肺组织，擦拭血迹后立即称量得组织湿重，将肺组织标本置于70℃烘干箱中72 h至恒重，称量干重，计算湿干比(W/D)。

3.TNF-α检测:用ELISA的方法检测肺组织匀浆中TNF-α的含量，具体步骤严格按照试剂盒说明书操作。

4.实时定量PCR检测Cx43 mRNA表达:采用Trizol法提取肺组织标本RNA，应用Du-640紫外分光光度仪测定总RNA的纯度，再逆转录成cDNA，以适量cDNA为模板，在TaqDNA聚合酶催化下行PCR扩增，以β-actin为内参照。HIF-1α上游引物:5’-GGAAATCGAACGGCTGGGCGT-3’，下游引物:5’-TCGCGTGAAGGGAAGAAGCGAT-3’，β-actin 上游引物:5’-GCACTGTGTTGGCATAGAGGTC-3’，下游引物:5’-ACGGTCAGGTCATCACTATCGG-3’，扩增条件为:95℃/2 min;95℃/2 min;95℃/10 s;60℃/30 s;70℃/45 s;共40个循环;之后自动4℃保存。所得CT值采用2-ΔΔc(t)法进行分析。

5.免疫组化检测肺组织中Cx43表达:肺组织标本用4%多聚甲醛溶液固定24 h，常规石蜡包埋、切片，采用链霉亲和素 －生物素 －酶复合物(streptavidin biotin complex，SABC)法进行免疫组化染色，具体步骤按试剂盒说明操作，DAB显色，光镜下观察肺组织细胞浆及细胞核出现棕黄色颗粒为阳性表达。每张切片随机选择10个视野(400×)，计数表达阳性的细胞个数，检测表达量的差异。

结 果

一、病理学检测结果

对照组大鼠肺泡结构清晰，未见明显病理变化;海水淹溺组大鼠肺组织结构紊乱，局部伴有肺不张，间质水肿;肺泡内可见出血灶，肺间质肺泡腔内可见大量炎细胞;乙酰化白藜芦醇预处理组大鼠肺组织结构尚清晰，间质水肿，炎细胞浸润等病理改变明显减轻;乙酰化白藜芦醇组未见明显异常(图1)。

图1 病理学检测结果

二、肺组织湿干比(W/D)结果

吸入海水4 h后，肺组织湿干比(W/D)明显增高(P＜0.05)，乙酰化白藜芦醇预处理能够明显降低肺组织的含水量，减小湿干比(P＜0.05)(图2)。

图2 湿干比(W/D)结果

三、ELISA检测结果

与正常对照组相比，海水淹溺组大鼠肺组织中TNF-α明显升高(P＜0.05)，乙酰化白藜芦醇预处理组大鼠肺组织中TNF-α含量比海水淹溺组明显降低(P＜0.05)。乙酰化白藜芦醇组肺组织中TNF-α含量与正常对照组无明显差别(图3)。

图3 TNF-α检测结果

四、Cx43 mRNA表达结果

正常对照大鼠基因表达水平视为“1”，其它各组与之相比较，得出相对表达量。大鼠吸入海水后，Cx43 mRNA表达量升高明显(P＞0.05)。乙酰化白藜芦醇预处理大鼠吸入海水后肺组织中Cx43 mRNA表达量仍然显著增高(P＜0.05)(图4)。

图4 Cx43 mRNA表达检测结果

五、Cx43免疫组化结果

大鼠吸入海水后，肺组织中Cx43染色阳性细胞减少，乙酰化白藜芦醇预处理大鼠吸入海水后肺组织中阳性表达的细胞数较淹溺组明显增多(图5)。

图5 Cx43免疫组化结果

讨 论

海水吸入最主要的致死原因是喉头、气管痉挛或大量液体进入肺泡导致的急性窒息，肺部的主要病理生理学变化为肺水肿和炎症反应。由于海水特有的高渗特性，进入肺泡后，迅速引起肺水肿［8］。同时，有动物试验研究表明，淹溺肺损伤动物模型肺组织中MPO，TNF-α 和 IL-1β 表达量增高［9］，表明海水对肺泡组织的直接损伤及海水淹溺后肺部急性炎症反应是其可能的发病机制。在本研究中，我们观察到吸入海水4 h后，大鼠肺水肿明显，伴有大量炎症细胞浸润，同时炎症因子表达量也明显增高。通过乙酰化白藜芦醇预处理的大鼠吸入海水后相关损伤有所减轻，同时炎症反应也得到一定程度缓解。

ALI和ARDS发生和发展过程中的重要特征是肺泡壁和肺间质水肿导致呼吸膜屏障功能紊乱和微血管通透性增加，大量富含蛋白的液体从血管和组织间隙进入肺泡腔，加重缺氧和炎症反应，进而增加ALI/ARDS的病死率［10］。研究表明，通讯功能降低可导致肺微血管通透性增加［11］。另外，Cx43表达量与单层血管内皮细胞的通透性呈负相关系［12］。本研究观察到，大鼠吸入海水后，在肺水肿发生的同时伴有肺组织中Cx43蛋白表达量降低，而乙酰化白藜芦醇通过提高Cx43的表达量减轻了肺水肿。

炎症反应是一系列复杂的病理过程，包括趋化因子、细胞因子的释放，单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等效应细胞的活化和迁移。而这些过程的发生都需要细胞间通讯功能的协调，细胞间的缝隙连接形成的跨膜通道为相邻细胞的物质交换和信息传递提供了快捷途径。有研究表明，连接蛋白Cx43可通过调控Ca2+信号通路调节肺部炎症反应的发展［3，5］。在本试验中我们发现，大鼠吸入海水后导致Cx43蛋白表达量降低，肺部炎症反应明显，但乙酰化白藜芦醇通过调控Cx43蛋白表达可缓解肺损伤。

近年来，Cx在肺组织中的表达和功能的研究逐渐增多，多种急/慢性肺脏病中都有涉及Cx。有研究表明脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)能够引起肺组织中Cx43 mRNA表达增高［13］，也有研究表明枪伤能够造成兔肺组织中Cx40表达量降低，造成水肿和炎症反应［11］。在我们的试验中，海水吸入导致大鼠肺组织中Cx43 mRNA表达增高，而蛋白表达降低，说明海水能够促进Cx43 mRNA转录但抑制其翻译。乙酰化白藜芦醇预处理组大鼠吸入海水后肺组织中Cx43 mRNA和蛋白含量均较淹溺组大鼠增高，说明乙酰化白藜芦醇通过促进Cx43的转录和翻译可保护海水淹溺型急性肺损伤。

总之，我们的结果证实细胞间的通讯功能在海水淹溺型急性肺损伤中发挥重要作用。Cx43表达降低促使肺水肿和肺部炎症反应的发生，而乙酰化白藜芦醇能够促进Cx43的转录和翻译，从而减轻肺损伤。这些结果部分解释了海水淹溺的发病机制，并为乙酰化白藜芦醇的临床应用提供了实验依据。

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