拓扑替康诱导肺癌细胞HTB-56凋亡早期线粒体膜电位的变化

高 丰 刘思思 韩佩妍 王武龙，2邹 瑞 王 刚 曹 阳 吴海歌王若雨 高文斌

2116622 辽宁大连，包头医学院第二附属医院放疗科

3116622 辽宁大连，大连大学附属中山医院肿瘤科4116622 辽宁大连，大连大学生命科学与技术学院

高 丰，刘思思，韩佩妍，等.拓扑替康诱导肺癌细胞HTB-56凋亡早期线粒体膜电位的变化［J/CD］.中华肺部疾病杂志:电子版，2013，6(1):51-53.

目前肺癌已经成为发病率、病死率最高的恶性肿瘤之一，近几十年肺癌的治疗尚未能获得较大的进展，非小细胞肺癌的5年生存率仍然低于15%，大部分患者多在确诊后1年内死亡［1-3］。拓扑替康(topotecan，TPT)是半合成喜树碱合成物，主要作用于拓扑异构酶Ⅰ(topoisomeraseⅠ，Topo-Ⅰ)，并与Topo-Ⅰ相结合，形成酶-DNA-TPT结合物，阻止肿瘤细胞DNA修复，进而导致肿瘤细胞双链断裂。TPT抑制肺癌细胞生长，诱导其凋亡可能涉及caspase-3、8、9及Fas-FasL系统的激活，但诱导其凋亡的机制尚存在争议。我们在前期基础研究上，初步明确了TPT对肺癌HTB-56细胞凋亡的影响［4-5］，本研究拟进一步观察TPT对肺癌HTB-56细胞线粒体的影响，并探讨TPT对线粒体早期功能的影响及其与细胞凋亡的关系。

材料与方法

一、实验材料

人肺癌细胞HTB-56细胞由本教研室保存，TPT是贵州汉方制药有限公司产品，JC-1为BioVision公司的产品，二甲基亚砜购于sigma公司DMEM购于Gibco公司。

二、实验方法

1.细胞培养:人肺癌细胞HTB-56培养于青霉素105IU/L、链霉素 100 mg/L，37℃，5%CO2，饱和湿度条件下，含有10%小牛血清的DMEM培养基中。实验用的细胞均处于对数分裂期。

2.确定实验用的TPT的浓度:依照前期实验结果确定 TPT 实验用量为 6.4 μmol/L［4-5］。

3.细胞线粒体膜电势检测:在TPT给药后分别于 0 h、1 h、2 h、4 h、8 h 检测细胞线粒体跨膜电位。参照JC-1试剂盒步骤进行实验。流式细胞仪分析，通过荧光颜色的转变检测线粒体膜电位的变化。检测在流式细胞仪FACSCALIBUR上进行。JC-1的单体和聚合物荧光信号分别在FL-1和FL-2探测器上获得。由于JC-1发射的双波长，使用电子补偿的纠正绿色荧光(单体)和红色荧光(聚合物)的重叠部分。图分析采用CELL QUEST软件进行，每组实验至少进行3次，图象显示代表性的结果。

4.琼脂糖凝胶电泳:细胞3×105接种，过夜贴壁，调节药物浓度，分别TPT作用12 h、24 h、48 h和72 h，收集细胞，离心，PBS洗 2次，加入 600 μl含10 mmol·L的 Tris-HC1，加入 10 mmol/L的 EDTA和2 g/L的Triton X-100的裂解液于4℃裂解10～15 min;将裂解液收集于1.5 ml的EP管中，与等体积酚混匀，抽提1次，12 000 r/min，4℃离心10 min取550 μl上清于另一EP管中，加入等体积的1︰1酚、氯仿混合液抽提1次，再次离心。取500 μl上清，加入300 mmol/L的乙酸钠和等体积的异丙醇，沉淀过夜。离心，70%乙醇洗涤2～3次;干燥后加入 TE(Tris10 mmol/L;EDTA 1.0 mmol/L 和0.6 g/L的Rnase A)37℃温育30 min;样品放在20 g/L的琼脂糖凝胶上电泳1 h，溴乙啶染色后在紫外灯下观察拍照。

结 果

一、线粒体膜电位变化

JC-1试剂盒测定结果表明，正常细胞的膜电位高，488 nm激发时发出很强的红色荧光，而凋亡细胞线粒体的膜电位发生去极化，红色荧光减弱，绿色荧光增强，绿/红荧光的比值发生了变化。图1显示:加入TPT药物作用4 h后可以引起细胞线粒体膜电位的下降，作用8 h后，细胞线粒体膜电位明显下降。且该两药物组的绿/红荧光比值与对照组比较，均有显著差异(P＜0.05)。8 h组的绿/红荧光比值与其他各药物配比组比较，有显著性差异(P＜0.05)。

图1 TPT作用于HTB-56细胞不同时间细胞线粒体膜电位(绿光与红光比值)的影响

二、琼脂糖凝胶电泳

经TPT处理48 h、72 h的HTB-56细胞出现明显的DNA-Ladder，对照组及12 h、24 h组未见明显的亮带影，见图2。

讨 论

TPT是半合成喜树碱合成物，其作用靶点主要在Topo-Ⅰ，通过与Topo-Ⅰ结合，形成酶-DNA-TPT稳定结合物，阻止DNA双链解螺旋的发生，抑制修复，进而导致双链断裂，产生抗肿瘤作用。TPT抗瘤谱广，可用于结肠癌、卵巢癌、肺癌、进展期的宫颈癌［6-7］。

肿瘤细胞恶性生长方式与其异常增殖、分化有关，而且与细胞凋亡异常相关。细胞凋亡的途径包括外部途径，即通过细胞外死亡受体激活细胞内的凋亡酶半胱氨酸特异性蛋白酶(caspase-8)，和内部途径，即通过改变线粒体外膜通透性(mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP)使多种促细胞凋亡因子从线粒体内外膜间隙(intermembrane space，IMS)释放到胞质，从而激活Caspase-9，最后激活Caspase-3。这些活化的Caspase降解细胞内的重要蛋白，引起细胞凋亡［8］。有研究认为，即使Caspase-9受抑制，仅有MOMP改变也可能导致细胞死亡［9］。

我们在前期试验中已证实了TPT对肺癌细胞HTB-56有抑制作用，其机制是诱导凋亡，且与caspase-3、8 有关［4-5］。线粒体与细胞凋亡关系密切，线粒体跨膜电位破坏是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件之一，其发生在染色质浓缩、DNA断裂等细胞核凋亡特征出现之前，线粒体跨膜电位崩溃，细胞凋亡不可逆转。本实验中应用JC-1检测早期膜电位的变化，在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物产生红色荧光，线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，产生绿色荧光。正常的细胞膜电位较高，而当出现凋亡时，膜电位下降。本实验中证实在4 h时该实验方法检测出线粒体膜电位的变化，经过继续培养至48 h，72 h通过琼脂糖凝胶电泳出现明显的凋亡。由此可见HTP-56细胞出现早期凋亡，且该凋亡与线粒体有关。线粒体是细胞维持生命活动的重要细胞器，在细胞存活及凋亡过程中发挥着重要的作用。

凋亡是一个复杂的现象，不同的诱因可通过相同的信号传导途径诱发细胞凋亡，并且不同的信号传导途径也不是孤立发挥作用，而是紧密联系和相互作用的，整个信号传导系统呈现复杂的网状调控结构。随着越来越多的研究，可以使得我们可以找到更多、更有效的治疗肿瘤的切入点，并且有效拮抗凋亡抑制因子的作用，最大限度地选择性地诱导肿瘤细胞凋亡，并有效地利用诱导凋亡来控制肿瘤。

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