采用PCR技术对难治性根尖周炎根管粪肠球菌的检测分析

刘志刚 莫浩勋 王群芳

(东莞市人民医院，广州 东莞 523000)

根管治疗的成功率已明显提高，但对难治性根尖周炎的处理依然难以达到满意效果，在难治性根尖周炎中，粪肠球菌的存在和研究是关注的热点。而PCR在口腔领域中的应用则较少，本课题将PCR技术引入口腔疾病治疗上进行应用研究，找出一种快捷有效的PCR技术来检测粪肠球菌的数量，分析粪肠球菌与难治性根尖周炎的关系，并通过对不同的临床症状与粪肠球菌的存在情况关系进行统计学分析，提示粪肠球菌在难治性根尖周炎中的作用，对难治性根尖周炎给以针对性治疗。

1 资料与方法

1.1 样本来源

本实验的临床样本采集选自东莞市人民医院口腔中心就诊的慢性根尖周炎根经三次换药仍有临床症状或体征的患者，拟迄择共100颗患牙为研究对象，男女性别随机，年龄段介于14～70岁。所有患者在近3个月内未服用过抗生素，无系统病史，阅读知情同意书后同意参与研究。记录临床患者的具体情况：姓名、性别、年龄、牙位、病史，且相关的临床数据无统计学差异。

1.2 症状检查及记录

症状体征(包括自发痛、咬合痛、叩痛、牙龈脓肿及瘘道)、影像学特征(根尖周是否有暗影，包括首次治疗后未愈合且渐进性增大或新出现的暗影)等。

1.3 标本采集方法

依据病例选择标准选取患牙，患牙抛光清洁后，用3%过氧化氧消毒患牙及周围2 cm直径范围各30s，安置橡皮障。 无菌高速手机裂钻，无菌水冷却下去除釉质、牙本质或残存充填材料后，棉卷隔湿，酒精棉球消毒窝洞，低速球钻揭去髓室顶。15# K锉探通根管，到达大约根尖孔位置(根尖定位仪)，消毒吸水纸尖插入根管中，吸取根管内液(干燥根管滴入少许生理盐水)，纸尖在根管内停留1分钟后取出。连续采样三次，将三支纸尖立即置于同一个盛有1ml 硫乙醇酸盐传送培养液的消毒离心管中。 冰浴转送实验室，-20℃冰箱保存备用。取样的根管长度的确定和临床症状均由同一位牙体牙髓专业医生检测和记录。

1.4 DNA提取

粪肠球菌检测相关的步骤；首先制定标准菌悬液制备，然后在细菌基因组做DNA的提取(按照细菌基因组快速提取试剂盒(上海捷瑞生物有限公司)的使用说明进行DNA提取。提取结果5μL用1%琼脂糖凝胶进行电泳，检测细菌基因组DNA的提取结果)。根据GenBank中粪肠球菌基因组中16S rRNA的保守序列，参考sedgley等文献[1]，设计引物．序列为：上游引物5′-CCGAGTG—CTTGCACTCAATTGG-3′;下游引物5′-CTCTTATG—CCATGCGGCATAAAC-3′。预期扩增的片段长度为138 bp。使用前参照说明书用纯水稀释成10μmol.·L，分装成每管100 μl备用。

1.5 PCR 反应

以提取的粪肠球菌标准株及样本中的细菌基因组DNA为模板，使用ABT 7500型核酸扩增荧光检测仪(美国应用生物系统公司，美国)进行PCR扩增，25μl． 反应体系：10×PCR缓冲液5 μl，Mg2+终浓度1.5～2.0 mM，10 mM dNTP 1 μl，5 U/μl Ex Taq酶0.2 μl，25 μmol/L引物各1 μl，cDNA为模板2 μl，去离子水加至50 μl。具体反应条件如下：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环数，最后一个循环72 ℃延伸10 min。取PCR扩增液5 μl，加入溴酚蓝2 μl，点样于1.5%琼脂糖凝胶(5.0 mg/l溴乙锭染色)，在TAE缓冲液中电泳45 min，紫外与可见分析装置观察并记录。用标准参考物确定产物相对分子质量的大小，电泳结束后将凝胶置于凝胶成像分析系统(BioRad公司，美国)中进行分析。结果判定，相对于阳性对照组，在138 bp出现特异性条带为阳性，否则为阴性。

1.6 统计学分析

采用SPSS 13 .0软件进行统计学分析，利用四格表χ2检验进行组内比较，分析不同症状及体征的病例中粪肠球菌的检出情况。

2 结 果

将收集的病例分为3组；A组为有临床症状患牙(包括自发痛、咬合痛)，B组为有体征的患牙(触痛、叩痛、牙龈脓肿和瘘道)，C组为既有症状又有体征的患牙(有根尖周病变)。结果显示3组临床症状患牙粪肠球菌检出率存在差异，但是不符合统计学研究意义。不同症状及体征的难治性根尖周炎中粪肠球菌检出率存在很大的差异，其研究结果以咬合痛的病例组(62.26%)与瘘道的病例组(71.43%)中中粪肠球菌的检出率明显高于其它症状表明粪肠球菌的检出。详细见表1。

表1 不同临床症状和体征的难治性根尖周炎中粪肠球菌检出率

3 讨 论

难治性根尖周炎的病因与粪肠球菌有关[1]尤其在临床症状明显的情况下。咬合痛的病例组与瘘道的病例组中中粪肠球菌的检出率明显高于其它症状表明粪肠球菌的检出，说明咬合痛与瘘道的病例中与粪肠球菌的存在有明显关系，与临床症状中的咬合痛密切相关。有临床症状与无临床症状的粪肠球菌检出率无统计学差异，但在咬合痛与非咬合痛的病例中粪肠球菌的检出率有显著性差异，提示粪肠球菌可能是导致咬合痛的主要病原菌[2]。

有临床症状且有根尖周明显破坏的病例较无临床症状无根尖周破坏的病例粪肠球菌检出率高，有根尖周破坏的病例与无根尖周破坏的病例中粪肠球菌的检出率存在显著性差异。表明再治疗根管内粪粪球菌的检出率与根尖周破坏呈正相关，而在根尖周破坏的情况下，有症状的病例较无症状的病例粪肠球菌检出率高。相关文献[3]分析急性根尖周炎根管内细菌，为药敏试验奠定基础。认为感染根管内的优势厌氧菌主要为类杆菌、梭杆菌、真细菌、丙酸杆菌、放线菌和消化链球菌等。

郭惠杰[4]等对慢性根尖周炎患牙根尖外表面的生物膜进行细菌学研究和形态学观察，了解生物膜中细菌的种类、组成及其超微结构。。认为慢性根尖周炎患牙的根尖外表面存在细菌生物膜结构，该生物膜的存在与临床上难治性慢性根尖周炎密切相关。孙慧斌等[5]通过对根管治疗失败病例根管内微生物进行分子生物学检测，研究失败病例根管内各种细菌的检出率及优势菌；分析临床症状和体征与特殊微生物的关系。选择PCR检测鉴定。根管治疗失败病例根管主要呈混合感染，共检出6种细菌，粪肠球菌是最常检出的细菌，产黑普氏菌与疼痛、衣氏放线菌与瘘道有一定的相关性。认为根管治疗失败的主要原因是根管内的微生物感染持续存在，根管治疗失败病例根管内微生物组成有其特殊性。初步分析：难治性根尖周炎的病因仍为细菌感染，是多细菌感染，粪肠细菌是最常提出的细菌。

[1] Siren EK,Haapasalo MP,Ranta K,et al.Microbiological findings and clinical treatment procedures in endodontic cases selected for microbiological investigation[J].Int Endod J,1997,30(2):91-95.

[2] Gomes BP,Pinheiro ET ,Sousa EL,et al.Enterococcus faecalis in dental root canals detected by culture and by polymerase chain reaction analysis[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod ,2006,102(2):247-253.

[3] 卢川.急性根尖周炎患牙根管内厌氧菌的初步分析[J].广东牙病防治，2002，10(1)：45-46.

[4] 郭惠杰.慢性根尖周炎患牙根尖外表面的细菌生物膜[J].北京大学学报·医学版，2009，41(5)： 571-574.

[5] 孙慧斌.根管治疗失败病例根管内微生物的分子生物学检测[J].实用口腔医学杂志，2010，1：96-99.