先兆子痫患者胎盘滋养细胞MMP-9表达及侵袭性研究

孙新六 刘秀兰 绍春月

(泰山医学院附属泰山医院，山东 泰安 271000)

先兆子痫是产前严重并发症之一，表现为高血压、蛋白尿和脑功能障碍[1]。预防先兆子痫的发生是妇产临床至关重要。此研究探讨胎盘基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase -9,MMP-9)与先兆子痫发生的相关性。

1 材料与方法

1.1临床资料 病例是2010年3月至2013年1月在本院就诊，均为首胎，其中先兆子痫患者32例，均龄28.6+7.2，另30例正常孕妇为对照，均龄27.3+ 6.5。孕期12周抽取外周血，凝固分离血清，-80℃保存，分娩后立即摘取胎盘绒毛膜组织，保存于-80℃。

1.2试剂 TRIzoL提取液，购于Invitrogen公司； 逆转录及PCR试剂盒购于TaKARa公司; Matrigel、Millicellchamber购于美国BD公司。

1.3先兆子痫病例筛选标准：血压>160/110 mmHg,尿蛋白>2.0g/24h,肝酶ACT或AST上升，并呈现脑障碍症状。

1.4总RNA提取 剪取约50mg胎盘绒毛膜组织，生理盐水充分漂洗，TRIzoL液低温匀浆，转入EP管中，充分裂解细胞，氯仿沉淀蛋白，异丙醇沉淀RNA，乙醇漂洗后，短暂干燥以无菌水充分溶解RNA，确保OD260/280=1.8～2.0，凝胶电泳显示RNA完整，将RNA液调至1.0 μg/μl。

1.5MMP-9 mRNA检测 引物设计，以Primer 5软件设计，同时在NCBI 上BLAST其特异性。

上游引物： 5‘-CCGCAGGGCCCCTTCCTTAT-3’

下游引物： 5’-GCCCACTTGGTCCACCTGGTT-3’

逆转录反应(10 μl体系): 含逆转录引物Oligo dT,dNTP混合物,RNA底物1 μg,42 ℃反应30 min,95 ℃ 5 min灭活逆转录酶。PCR反应(反应体系20?l):取逆转录产物2 μl，加入PCR反应混合液，反应程序(30个循环)：94 ℃, 40 s变性，60 ℃,40 s复性，72 ℃1min延伸。最后72 ℃充分延伸10 min,同时扩增内参照基因β-actin。2%琼脂糖凝胶电泳，Alpha图像分析仪拍照，进行半定量分析。

1.6外周血MMP-9蛋白检测 采用夹心法ELISA法，微孔板包埋有抗MMP-9抗体，与血清中MMP-9蛋白结合后，加入酶标记的抗MMP-9二抗，最后加入反应底物显色，测OD值。以标准品测定值做标准曲线，求得各样品MMP-9含量。

1.7侵袭性试验

1.7.1分离滋养细胞: 分三组: 先兆子痫组32例,正常孕妇组30例,早期引产组10例(均胎龄3.2月)。产出或引产的胎盘, 立郎无菌剪取一小块,分离剪下绒毛膜滋养层,在含500 U/ml胶原酶、200 U/ml透明质酸酶和0.2 mg/ml DNA酶PBS液中37 ℃ 消化20 min。离心弃上清，加入含0.25%胰蛋白酶、2 nM EDTA、0.2 mg/L 消化20 min后，转入淋巴细胞分离液上层，2000转/min离心15min,收集细膜层，以PBS漂洗数次。细胞与磁珠标次的CD-45抗体混合，在磁分离仪作用下除去CD-45阳性细胞，余下细胞为滋养细胞。

1.7.2侵袭实验 吸取人工基底膜液Matrigel 50 μl均匀涂布在Millicell 小室膜上,成胶30 min ,紫外线下照射过夜.分三组分别取先兆子痫组、正常对照组，正常早期胎盘组分离纯化的滋养细胞2×105个接种到成胶的Millicell 小室中, 并将Millicell 小室置于培养孔板内。培养30 min,弃去未吸附的细胞，换上新鲜培养液培养48 h ，取出Millicell 小室 ,擦去Matrigel胶层,PBS 液漂洗数次,3%甲醛固定20 min ，PBS液漂洗。 加入抗人胎盘催乳素(HPL)抗体，4 ℃过夜，加过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，最后加反应底物DAB显色。取下Millicell chamber 膜贴在载玻片上，观察侵袭的滋养细胞，在光镜下( ×20) 每个膜分别计数5 个视野的穿膜细胞数,计算平均每个视野的细胞数。

1.8统计学分析 以SSPS 12.0软件分析,MMP-9相对表达率进行t检验,滋养层细胞穿透实验三组进行方差分析,数据以mean±SD 表示，均以P<0.05为差异显著。

2 结 果

2.1MMP-9 mRNA表达 扩增出的 MMP-9 为 196bp(图1)

先兆子痫组MMP-9相对β-actin表达率为0.23+0.06 ，正常对照组MMP-9相对β-actin表达率0.52+ 0.12。先兆子痫组MMP-9表达率减少，经t检验两组差异显著(P<0.05)

图1 MMP-9 mRNA表达,M:标准分子量;1、2：先兆子痫组；3、4：正常对照组。

2.2血清MMP-9蛋白浓度 先兆子痫组血清中MMP-9浓度为102.4+ 27.2 ng/ml, 而正常组血清中MMP-9为287.4+ 46.2 ng/ml, 经t检验两者差异显著(P<0.01).

表1 外周血MMP-9浓度

*P< 0.01,与正常组比较差异显著

2.3滋养细胞侵袭 各组滋养细胞侵袭见表2,先兆子痫患者胎盘滋养细胞侵袭力下降(透膜细胞数24.2 + 5.6),与正常孕妇滋养层细胞侵袭力(透膜细胞数102.6+ 14.3)比较差异显著(P<0.01);与正常孕妇晚期胎盘比较,早期胎盘滋养层细胞侵袭力强(透膜细胞数187.4+21.2),两者显著(P<0.01)。

表2 胎盘滋养细胞体外侵袭实验

*与正常孕妇组比较,P<0.01

3 讨 论

基质金属蛋白酶9(MMP-9)功能是降解和破坏细胞外基质中的胶原和明胶,促进血管生成及增强上皮细胞的运动能力[2]。研究表明，多种肿瘤细胞释放基质金属蛋白酶9，降解基底膜和IV型胶原，促进肿瘤的侵袭和恶变[3]。胎盘形成中，绒毛膜滋养层细胞对子宫内壁进行侵袭, 滋养层细胞侵入母体螺旋动脉,破坏血管基底层,将这些血管变成高容量血道,从而增进母血的输送[4]。先兆子痫及产小体婴儿归因于滋养层细胞侵袭力弱从而胎盘形成不良。

基质金属蛋白酶9表达降低，使基底膜中胶原降解减弱，绒毛膜滋养层侵袭浅，胎盘在子宫内壁着床不良，使胎儿供血不良，易诱发先兆子痫及流产[5]。

本实验中先兆子痫患者组滋养层细胞MMP-9 mRNA和外周血MMP-9蛋白相对正常孕妇表达均下降，显示MMP-9表达与先兆子痫存在相关性。早期胎盘滋养层细胞侵袭强，随着孕程的进展，胎盘的成熟，滋养层细胞侵袭力逐渐减弱，与之相应的，MMP-9的表达也逐渐下降，早期胎盘MMP-9表达比晚期胎盘表达强。本实验为临床监控先兆子痫的发生提供了一个指标，检测外周血MMP-9水平可评估临床先兆子痫发生的风险性。

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