SLC17A8基因与听神经病*

齐悦 综述 王秋菊 审校

听神经病是一种内毛细胞和听神经突触和/或听神经本身功能不良所致的听力障碍，是导致感音神经性听力障碍的重要疾病之一，其主要的听力学特征包括言语识别率与纯音听力不成比例的明显下降，诱发性耳声发射(EOAE)和/或耳蜗微音器电位(CM)正常，而耳声发射对侧声抑制效应消失，听性脑干反应(ABR)缺失或严重异常，中耳镫骨肌声反射引不出或阈值明显升高等[1]。

听神经病病因复杂，大体上可分为环境因素和遗传因素。相关的环境因素包括新生儿高胆红素血症、营养代谢障碍、自身免疫、缺氧等。近些年来，随着遗传学研究的深入，发现了一系列听神经病相关基因，其中，与非综合征型听神经病相关的基因有OTOF[2]、 PJVK[3]、DIAPH3[4]和12S rRNA (T1095C)[5]，与综合征型听神经病相关的基因有PMP22[6]、MPZ[7]、NF-L[8]、NDRG1[9]、GJB1[10]、 GJB3[11]、OPA1[12]、TMEM126A[13]、FXN[14]、TIMM8A[15]、WFS1[16]和MTND 4 (11778mtDNA)[17]，此外还定位了和听神经病相关的基因座位AUNX1[18]。这些基因选择性地损伤听觉传导通路的不同部位，导致相应的临床表型，提示遗传因素在听神经病发病中起着重要作用。根据损伤部位不同，听神经病可分为：①听觉神经病变型(突触后型)；②听觉突触病变型(突触及突触前型)；③非特异型听神经病变[19]。

SLC17A8基因编码的囊泡谷氨酸转运体3(vesicular glutamate transporter 3，VGLUT3)和第一个确诊的非综合征型听神经病致病基因OTOF[2]编码的Otoferlin 蛋白均作用于突触前，调节内毛细胞谷氨酸的传递，基因突变导致听觉传导系统谷氨酸传递障碍而致病。此外，研究发现SLC17A8基因缺陷动物模型的临床表现型与听神经病十分相似[20]。因此， SLC17A8基因与听神经病的发病联系密切，可能是听神经病的致病基因之一。

1 SLC17A8基因的结构

SLC17A8基因于2002年被首次克隆并命名[21]，基因全长80 kb，定位在染色体12q23.1区域，共有12个外显子。 SLC17A8基因突变可引起DFNA25耳聋。Greene等[22]将DFNA25基因座定位在染色体12q21-q24.5上，在这段长达14.3 Mb的DNA序列里，包括了60多个基因，而SLC17A8基因就是其中之一。

SLC17A8基因编码的蛋白质是囊泡谷氨酸转运体3(VGLUT3)。VGLUT3蛋白全长589个氨基酸，包含10个TM结构域，8个跨膜片段和一个长的C末端。VGLUT3蛋白属于溶质载体家族17，是该家族第8个成员，目前已发现了VGLUT的3个亚型(VGLUT1、VGLUT2、VGLUT3)，VGLUT3与VGLUT1有72.5% 的同源性，并与VGLUT2有 72%的同源性。VGLUT3外显子5和6编码的氨基酸具有高度保守性[20]，人类与褐家鼠、线虫、黑腹果蝇的同源核酸及蛋白质序列进化分析一致。

2 SLC17A8基因的表达分布与功能研究

Fremeau等[23]对小鼠进行免疫组织荧光分析，发现VGLUT3蛋白在中枢神经系统广泛表达，海马、齿状回、大脑新皮质、纹状体的胆碱能神经元、5-羟色胺(5-HT)能神经元以及GABA能神经元中均有VGLUT3蛋白分布。同时，Fremeau等还对VGLUT3进行了亚细胞定位研究，发现VGLUT3标记在胞浆囊泡，而非定位在细胞核。董玉琳等[24]在大鼠脊髓部分星形胶质细胞内也发现了VGLUT3的表达。王远等[25]通过抗生素蛋白-生物素化的过氧化酶复合方式，以二氨基联苯胺作为染色剂，用免疫组织化学染色方法分析正常成年SD大鼠VGLUT3蛋白在前庭外周系统中的分布特征，发现不同细胞免疫染色的强度明显不同：囊斑、壶腹嵴感觉上皮细胞、毛细胞的VGLUT3免疫反应为强阳性，囊斑、壶腹嵴传入神经纤维则呈现为VGLUT3弱阳性。免疫物质均局限于细胞浆，而在细胞核中缺乏，这一亚细胞定位与Fremeau等[23]在中枢神经系统的研究发现类似。Obholzer等[26]研究表明， VGLUT3蛋白在斑马鱼侧线器官和内耳毛细胞特异表达。此外，VGLUT3蛋白在啮齿类动物和人类视网膜无轴突细胞、小鼠的肝脏、肾脏也有表达[27，28]。

为了研究VGLUT3蛋白在活体内的功能，Seal等[29]首次克隆了SLC17A8基因敲除小鼠，发现VGLUT3蛋白缺失的小鼠表现为极重度聋。VGLUT3蛋白在毛细胞谷氨酸释放中有着重要的起动作用，由于VGLUT3蛋白的缺陷，毛细胞缺少谷氨酸释放，使SLC17A8基因敲除小鼠部分耳蜗螺旋神经节在早期即出现了退化。此外，SLC17A8 基因敲除小鼠还可出现癫痫，伴显著的行为改变。由此推论VGLUT3表达引起谷氨酸的释放，不仅在听觉通路发挥必不可少的功能，也在发育以及控制皮层兴奋性中起着重要的作用。

Ruel等[20]敲除了小鼠SLC17A8基因外显子2，导致基因复制终止，从而使等位基因的功能完全丧失。该研究发现SLC17A8外显子2定向缺失的小鼠缺乏对声刺激的听神经反应，小鼠2周大时，膜电容测量表明，SLC17A8基因突变小鼠Ca2+诱发的突触囊泡转运正常，SLC17A8缺失不会造成内毛细胞传入突触主要结构的变化。扫描电镜观察显示，SLC17A8基因敲除小鼠有完整的毛细胞，内外毛细胞的静纤毛形状正常，除了耳蜗有一些散在的内毛细胞缺失(不到内毛细胞的总数的1%)，内毛细胞在数量上并无明显改变。但是，在SLC17A8基因敲除小鼠的内毛细胞传入神经元，螺旋神经节细胞的数量明显减少。由此推断，在谷氨酸释放到听神经末梢受体之前，VGLUT3在感觉性内毛细胞的突触囊泡积累谷氨酸，SLC17A8缺陷小鼠的耳聋由囊泡摄取和释放谷氨酸的特异性缺陷造成，在内毛细胞突触中，VGLUT3 对听觉编码是不可缺少的。 此外,Ruel等还发现野生型和突变型小鼠在研究的所有刺激频率和强度下DPOAE都没有显著差异，说明两者外毛细胞功能正常。野生型和杂合型小鼠均引出了ABR，纯合突变型小鼠虽然也引出了ABR，但ABR振幅较杂合型小鼠明显降低。

Obholzer等[26]敲除了斑马鱼VGLUT3外显子2，外显子2缺失能够阻止mRNA翻译成VGLUT3蛋白，发现突变体斑马鱼突触小泡数量减少，突触后动作电流缺少。推测VGLUT3突变个体，毛细胞带状突触中囊泡含有的谷氨酸水平降低，囊泡数量也减少，不足以在一级神经元中产生动作电位，最终导致毛细胞突触信号传递缺陷。

以上研究提示VGLUT3蛋白在毛细胞突触的谷氨酸传递中起重要作用。VGLUT3蛋白位于毛细胞突触囊泡膜上，谷氨酸的摄取由三磷酸腺苷酶产生的质子依赖的电化学梯度所驱动，对底物L-谷氨酸有着高度的特异性[30]，能特异装载毛细胞胞浆中的谷氨酸进入突触囊泡内[31]，突触囊泡和突触前膜接触、融合，进而通过胞吐作用，将谷氨酸释放到突触间隙。突触间隙的谷氨酸作用于突触后膜的谷氨酸受体，产生动作电位，传递听觉信号(图1a、b)。VGLUT3缺陷的个体，由于囊泡上谷氨酸转运异常，进入突触囊泡内的谷氨酸缺乏，进而使释放到突触间隙的谷氨酸减少，毛细胞突触传递缺陷，最终导致听力损失(图1c)。这一机制与OTOF基因编码的蛋白质otoferlin十分相似，otoferlin蛋白特异表达在耳蜗和前庭毛细胞的突触囊泡上，为一种钙离子感应器，在内毛细胞带状突触处促使突触囊泡与突触前膜紧密融合，在内毛细胞突触囊泡的胞吐过程中发挥重要作用[32，33]，从而将神经递质释放到突触间隙，otoferlin蛋白缺陷个体这一谷氨酸传递过程受阻，成为听神经病患者听力损失的致病原因[2]。由此可见，otoferlin 蛋白与 VGLUT3 蛋白均表达于突触前囊泡膜上，调节神经递质的传递与释放，无论是VGLUT3还是otoferlin缺陷，最终都将会导致谷氨酸释放到突触间隙减少，影响谷氨酸的信号传递功能。研究已经证明，otoferlin 蛋白改变与听神经病的发病密切相关，临床表现为非综合征型听神经病[2]，而VGLUT3蛋白与听神经病的相关性，目前国内外尚无相关报道。

图1 a.谷氨酸表达与功能示意图；b.正常VGLUT3的谷氨酸转运机制；c.突变体VGLUT3的谷氨酸转运功能障碍机制

SLC17A8基因敲除小鼠表现为重度听力损失，DPOAE正常，ABR振幅降低，这也与听神经病的临床表现十分相似，结合otoferlin蛋白与VGLUT3蛋白相似的致病机制，推测VGLUT3 蛋白可能与听神经病具有一定的相关性。

3 SLC17A8基因筛查情况

Ruel等[20]对家族1(捷克血统的美国家系)和家族1 490(德国血统的美国家系)进行DNA测序，发现SLC17A8基因是常染色体显性遗传、非综合征型、感音神经性聋的致病基因，表现为进行性的高频非综合征型听力损失，其发病与年龄增长密切相关。通过对这两个无血缘关系的家系基因共分离，发现了一个相同的杂合错义突变，即外显子5的核苷酸改变(c.632C/T)，这一突变导致氨基酸改变(p.A211V)，而p.A211V突变在267例对照组中及单核苷酸多态性数据库均未发现。蛋白质p.A211V突变分子模型提示氨基酸残基A211在第4和第5跨膜域之间的胞质短交联区域，这个突变位点位于SLC17A8基因编码的囊泡谷氨酸转运体3(VGLUT3)的孔隙，缬氨酸替代了丙氨酸，可能会增加位阻现象，从而影响谷氨酸配体从胞浆进入到转运蛋白孔隙，再进入囊泡这一过程，最终造成了VGLUT3的功能障碍。

自2001年首次鉴定DFNA25 基因座，并于2008年发现编码VGLUT3的SLC17A8 基因至今，国内外对SLC17A8基因及其编码蛋白VGLUT3的研究多集中于其表达分布和动物模型研究，对人类SLC17A8基因筛查的研究较少，迄今为止，仅在美国患者中发现该基因的1种有致病意义的错义突变c.632C/T(图2)。目前，尚未在中国听神经病患者及其他耳聋患者中发现该基因的突变。

4 展望

虽然听神经病分子遗传学研究不断取得新进展，听神经病相关基因不断被发现，但仍存在许多尚未被发现的听神经病相关基因。基因检测可以为听神经病的致病机制、病理分型、治疗方式的选择、预后提供理论依据。如OTOF基因突变的个体，由于内毛细胞谷氨酸释放障碍，表现为听觉突触病变型听神经病，进行人工耳蜗手术治疗可取得良好疗效[34]。与OTOF作用机制相似的SLC17A8基因，是否也与OTOF基因一样是听觉突触病变型听神经病的致病基因，对于SLC17A8基因导致的听力损失是否也可通过人工耳蜗手术取得良好疗效，这些均有待于进一步研究。

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