五步蛇毒凝血酶样酶分离纯化

苏煌财，许云禄，林玉仙 （．福建医科大学蛇毒研究所，福建 福州350004；．福州市第一医院，福建 福州350009）

凝血酶样酶（thrombin－like enzyme，TLE）是蝮亚科毒蛇蛇毒中存在较广的一个组份，将纤维蛋白原降解为纤维蛋白，降低血浆中纤维蛋白原的浓度，起到抗凝作用。对五步蛇毒中凝血酶样酶组分纯化表征的研究已有报道［1－4］。从蛇毒中纯化得到的凝血酶样酶，纯度难以控制，存在毒副作用等问题。本研究利用现代液相色谱层析技术进一步纯化，生产出高纯度的凝血酶样酶。

1 材料

AKTAexplorer蛋白纯化系统（批号18111241）、Hofer电泳仪（批号80614935）、Superdex 75 prep grade（批号17104402）、Superdex 30 prep grade（批号17090501）、DEAE－Sepharose Fast Flow（批号17509001）均为美国Pharmacia Biotech；UV－2501PC分光光度计（日本SHIMADZU，批号80211233）；SDS（批号2AP105100）、Tricine（批号CAS＃5704041）均为上海生工生物工程有限公司AMRESCO分装；Tris（美国BIOASIA Biotech，批号29190202104）；Mark蛋白质分子量标准（14．4～116 kDa）（上海生物化学研究所，批号 D0033－1）；其他试剂均为国产分析纯。

2 方法与结果

2．1 五步蛇毒凝血酶样酶的分离经Superdex 75分子筛色谱柱层析 五步蛇粗毒5．0g溶于20 mL 0．01 mol·L－1Tris－HCl缓冲液（pH8．6）中，4℃过夜；经10 000 r·min－1离心15 min，上清液上样于Superdex 75柱（2．6 cm×86 cm）。溶剂为0．01 mol·L－1Tris－HCl－（0．5 mol·L－1）NaCl缓 冲 液 （pH 7．0），流速2 mL·min－1，全部收集，每管5 mL，测OD280nm值。分离结果见图1，蛇毒粗品分为AAV－（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ）6个峰，参照相应体外凝血活性测定方法［2］，峰Ⅰ、Ⅱ样品均有TLE活性。经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。分开收集含有TLE活性的对应峰。

2．2 五步蛇毒凝血酶样酶的纯化

2．2．1 经DEAE－Sephrose F．F阴离子交换柱层析取“2．1”项的活性Ⅱ峰上样于 DEAE－Sephrose F．F柱（2．6 cm×25 cm），以0～0．25 mol·L－1NaCl线性洗脱，溶剂为0．01 mol·L－1Tris－盐酸缓冲液（pH 8．4），流速3 mL·min－1，部分收集，每管8 mL，测OD280nm值。分离结果见图2，分为AAV－Ⅱ（1～6）6个峰，峰3样品有体外凝血活性。经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。收集含有TLE活性的对应峰。

图1 Superdex75柱色谱图Fig 1 Gel filtration of Agkistrodon acutus venom on Superdex 75

图2 DEAE－Sephrose F．F柱色谱Fig 2 Ion－exchange chromatography of AAV－II on DEAE－Sepharose Fast Flow

2．2．2 经Superdex 30分子筛色谱柱层析 取“2．2．1”项的活性3峰上样于 Superdex 30柱（1．6 cm×75 cm），以双蒸水洗脱，流速2 mL·min－1，部分收集，每管3 mL测OD280nm值，分析结果见图3，分为 AAV－Ⅱ3－（1～3）3个峰，峰1样品有体外凝血活。经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，判断是否为纯品。收集含有TLE活性的对应峰。

图3 Superdex 30柱色谱图Fig 3 Gel filtration of AAV－Ⅱ3 on Superdex 30

2．3 性质测定 参照Amersham Pharmacia公司的蛋白电泳技术手册［5］操作，SDS－PAGE的浓缩胶4%，分离胶12%。“2．2．2”项下获得的各组分经SDS－PAGE检测，峰1组分呈单一条带，达电泳纯，相对分子质量约为25 kDa（图4）。

图4 SDS－PAGE电泳图谱Fig 4 SDS－PAGE analysis of AAV－Ⅱ3－1

3 讨论

从五步蛇毒中提取的凝血酶样酶制剂在治疗急性脑梗死方面疗效显著。但在临床应用中发现有可能致过敏反应，血小板下降等问题。这些不良反应可能与制剂的纯度不足等有关。因此，通过改进工艺提高质量，可获得更好临床效果，减少不良反应是必要且可行的尝试。

本研究进行分离纯化工艺考察。五步蛇毒经Superdex 75分子筛色谱柱层析，受上样量、洗脱流速、盐浓度、pH值的影响，其中影响最大的为pH值，其次为盐浓度；Superdex 30分子筛色谱柱不仅有除盐的功能，还有纯化的作用。

已有文献报道［2］，五步蛇毒中有3个凝血酶样酶同工酶，相对分子质量为14～66 kDa。本课题采用新一代色谱柱Superdex 75、DEAE－Sephrose F．F、Superdex 30等，经几步层析去除杂蛋白，分离纯化效果显著，取得一种凝血酶样酶纯品，相对分子质量约为25 kD。本试验重复性佳，适用于大规模生产。

［1］Ouyang C，Chen YC，Teng CM．The clotting activity of the thrombin－like enzyme ofAgkistrodonacutus（hundred－pace snake）venom［J］．Toxicon，1979，17（3）：313－316．

［2］刘广芬，王晴川，陈清澄，等．尖吻蝮（Agkistrodonacutus）蛇毒凝血酶样酶的分离、纯化及其生化药理研究［J］．福建医学院学报，1989，23（4）：303－308．

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［4］翟宁，陈正杰，冯军，等．尖吻蝮蛇毒中一种新类凝血酶的分离纯化［J］．中国医药工业杂志，2005，36（10）：601－603．

［5］Amersham Pharmacia Biotech．Protein electrophoresis technical manual［M］．New York：Amersham Pharmacia Biotech，1999：13－19．