气相色谱－质谱法测定人血浆中丙泊酚的浓度及药动学

肖仲祥，郑海珍，郑海燕，赵乐萍，胡国新 （．乐清市人民医院药剂科，浙江 乐清5600；．乐清市人民医院麻醉科，浙江 乐清5600；．温州医学院药学院药理教研室，浙江 温州505）

丙泊酚（propofol，又称异丙酚）为烷基酚类短效静脉麻醉药。具有静脉注射后迅速分布于全身，起效快，作用时间短，苏醒迅速完全，不良反应少，不留后遗症，剂量易于掌握等优点。被广泛应用于临床。目前，文献报道的丙泊酚血药浓度检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）［1－3］和气相色谱质谱联用法（GCMS）［4］。HPLC的检测具有检测时间长、所需样品多以及检测灵敏度低等缺点，已报道的GC－MS检测方法基本都有样品处理繁琐、操作复杂等缺点，本研究综合参考相关文献，采用气相色谱－质谱法测定丙泊酚的血药浓度，并且对样品处理和检测作了相应的一些改进，本方法具有所需样品量少、操作简单和检测灵敏度高等优点。为科研及临床手术中丙泊酚血药浓度的监测提供了一种更为准确、灵敏、快速的检测方法。旨在为临床合理用药，保证安全，避免不良反应，提供确切而科学的理论依据。

1 材料与方法

1．1 仪器 气质联用仪（美国安捷伦6890N－5975B GC／MSD）。

1．2 药品与试剂 丙泊酚标准品（北京费森尤斯卡比医药有限公司，批号90318）；麝香草酚（分析纯）；丙泊酚注射液（北京费森尤斯卡比医药有限公司，批号10CH5153）；甲醇一级色谱纯；乙腈一级色谱纯。

1．3 受试者选择 选取10名健康男性志愿者，均来自我院接受无痛胃镜的体检人员，年龄21～24岁，体质量（60±5）kg，无烟酒嗜好，无神经系统、精神异常及代谢异常等病史，血尿常规、肝肾功能及心电图等检查均正常，身体状况良好。受试前2周至整个试验期间禁烟、酒和禁服其他任何药物。受试过程全程在麻醉科医师的操作下完成，试验方案经本院医学伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。

1．4 给药方法与样品采集 10名受试者均于检查前完成术前三大常规、肝功能检测，术前禁食6 h，禁饮4 h，无术前用药。开放右前臂静脉，鼻导管3 L·min－1给氧。全程心电监护，密切观察生命体征。静脉注射异丙酚1．5 mg·kg－1。给药2 h后方可再饮水，6 h后统一用餐。在静脉麻醉前取空白血，麻醉后2，5，10，15，20，25，30，45，60，90，120 min各时间点采集静脉血2 mL，置入肝素抗凝试管，即刻100×g离心5 min，取血浆至于－65℃冰箱保存直至测定丙泊酚血药浓度。

1．5 色谱、质谱条件 色谱柱为HP－5MS毛细管柱（30 m×0．25 mm×0．25μm），载气为高纯氦气，载气流速为1．0mL·min－1，进样口温度为250℃，进样方式为分流进样，进样量1μL，分流比5∶1。升温程序：起始温度100℃，以20℃·min－1升温到250℃。质谱接口温度250℃，离子源EI温度为230℃；电子轰击能量70 eV，四极杆温度为150℃，扫描范围40～550 amu，全离子扫描；溶剂延迟为5．0min。选择离子采集（SIM）。丙泊酚碎片离子m／z为163；麝香草酚碎片离子m／z为135。GCMS－SIM分成2组，Ⅰ组设定135，Ⅱ组设定163。

1．6 标准溶液的配置 用灵敏度为0．1 mg的电子天平准确称取丙泊酚标准品10．0mg，用甲醇溶解，于100 mL量瓶内定容，最终质量浓度为100 mg·L－1的工作液。麝香草酚标准品10．0mg，用甲醇溶解，于100 mL量瓶内定容，最终质量浓度为100 mg·L－1，然后用甲醇稀释成质量浓度为2 mg·L－1的标准应用液（内标应用液）。

1．7 血浆样品处理方法 准确吸取待测血浆0．5 mL置于10 mL具塞玻璃试管中，加入内标液麝香草酚100μL（2 mg·L－1）轻摇混匀，1 mL纯化水漩涡混匀，再加入0．2 mL的硼酸盐缓冲剂（pH9），翻转混匀（20 r·min－1，5 min）；加乙腈1 mL，充分混匀后，离心（3 000 r·min－1）10 min后被分成两层，取上清液750μL，转移至具塞玻璃试管中，取1．0 μL进样分析。

1．8 药动学分析 血浆药物浓度采用DASver 2．0软件进行分析，根据测定的浓度－时间拟合关系进行运算；房室模型选择用AIC值比较，同一权重下，选择AIC值最小的模型进行数据拟合。

2 结果

2．1 色谱行为 在上述色谱条件下，丙泊酚与内标物分离良好，血浆中的杂质不干扰测定，色谱图见图1。

图1 空白血浆（A）、空白血浆加标准品（B）和血浆样品（C）的色谱图Fig 1 Chromatograms of blank serum（A），blank serum spiked with standard（B）and sample（C）

2．2 标准曲线及定量下限 配成质量浓度相当于0．10，0．50，1．00，2．00，4．00，8．00，10．00mg·L－1的血浆标准品溶液，平行样本3份，再按“1．7”项下方法处理后，测定丙泊酚峰面积As、内标峰面积Ai。以As／Ai为横坐标（X），以所对应各点浓度（C）为纵坐标（Y）绘制标准曲线。经最小二乘法线性回归，丙泊酚的标准曲线回归方程为：Y＝16．993X＋0．151 2（r＝0．998 9），表明血药质量浓度在0．1～10 mg·L－1范围内有良好的线性关系。按信噪比10∶1计算，丙泊酚的定量下限为0．1 mg·L－1。

2．3 回收率试验

2．3．1 相对回收率 配成低、中、高3种质量浓度（0．40，2．00，8．00mg·L－1）的血浆标准品溶液，每种浓度5份，再按“1．7”项下方法处理后，依据标准曲线计算检测量。以检测量与加入量的比值计算相对回收率。上述3种浓度测定结果均在85%～115%范围内。结果见表1。

2．3．2 绝对回收率 配成低、中、高3种质量浓度（0．40，2．00，8．00mg·L－1）的血浆标准品溶液，每种浓度5份，再按“1．7”项下方法处理后测定，记录丙泊酚的峰面积，为该浓度血浆标准的峰面积。再分别配制质量浓度为0．40，2．00，8．00mg·L－1丙泊酚标准品溶液，直接5．0μL进样检测；记录不同浓度丙泊酚的峰面积，为该浓度的纯标准品的峰面积。计算血浆标准的峰面积与纯标的峰面积的比值，即为绝对回收率。结果见表1。

2．4 精密度 配成低、中、高3种质量浓度（0．40，2．00，8．00mg·L－1）的血浆标准品溶液，每种浓度5份，再按“1．7”项下方法处理。各浓度分别在同一日内测定，计算日内精密度。在连续不同日内重复测定5次，计算日间精密度。结果见表2。

表2 丙泊酚日内及日间精密度测定结果（±s，n＝5）Tab 2 Intra－day precision and inter－day precision of propofol in human palsam（±s，n＝5）

表2 丙泊酚日内及日间精密度测定结果（±s，n＝5）Tab 2 Intra－day precision and inter－day precision of propofol in human palsam（±s，n＝5）

加入量／mg·L－1日内 日间测得量／mg·L－1 RSD／% 测得量／mg·L－1 RSD／%0．40 0．40±0．02 2．97 0．40±0．03 3．80 2．00 2．01±0．12 5．20 2．02±0．08 2．30 8．00 8．0±0．4 4．38 8．0±0．6 6．42

2．5 样品稳定性 配制低、中、高3种质量浓度（0．40，2．00，8．00mg·L－1）的丙泊酚标准血浆样品溶液，在室温下放置0，6，12，24 h后再经“1．7”项下方法处理后进样检测，各时间点每种浓度3份，记录结果；另分别在－65℃冰箱冰冻保存1周，2周和4周后，再经“1．7”项下方法处理后进样检测，各时间点每种浓度3份，记录结果，结果显示：丙泊酚血浆样品在室温放置24 h以内测定，结果没有明显变化；在－65℃冰箱冰冻条件下冷藏一个月内测定，结果同样没有明显变化。说明血浆样品在室温放置和冰冻保存的条件下，均有很好的稳定性。

2．6 血药浓度－时间曲线 10名健康志愿者单剂量注射丙泊酚1．5 mg·kg－1后，用建立的 GC－MS条件测定不同时间的丙泊酚平均血浆药物浓度－时间曲线见图2。

图2 丙泊酚的药时曲线Fig 2 Plasma concentration－time curve of propofol

2．7 药动学参数 血浆药物浓度经DAS2．0程序处理，用房室模型估算药动学参数；10名健康志愿者单剂量注射丙泊酚1．5 mg·kg－1后，血浆丙泊酚的主要药动学参数见表3。

3 讨论

目前文献报道的丙泊酚血药浓度的测定方法主要有高效液相色谱法［1－3］及气相色谱质谱法［4］。本实验由于受试者给予的剂量较小，血药浓度较低，因而选择灵敏度高的气相色谱质谱法。关于提取血浆中丙泊酚的方法主要有液液萃取法和蛋白沉淀法，采取的萃取液和沉淀剂有乙醚、甲醇、氯仿－醋酸乙酯以及高氯酸等。文献报道的提取方法基本都操作复杂、处理繁琐且安全性不高等缺点。在预实验过程中发现直接用乙腈萃取与文献［4］报道的氯仿－醋酸乙酯萃取可以到达相仿的萃取率，并且操作简单、提取率稳定，方法符合生物制品质量控制要求。笔者经过比较后，最终确定以硼酸盐碱化血浆后直接用乙腈萃取，操作简单，分离完全，结果可靠，具有稳定性好、回收率高等特点。

表1 丙泊酚测定方法的相对回收率和绝对回收率（±s，n＝5）Tab 1 Relative recovery and absolute recovery of propofol in human palsam（±s，n＝5）

表1 丙泊酚测定方法的相对回收率和绝对回收率（±s，n＝5）Tab 1 Relative recovery and absolute recovery of propofol in human palsam（±s，n＝5）

加入量／mg·L－1 检测量／mg·L－1 相对回收率／% 血标峰面积 纯标峰面积 绝对回收率／%0．40 0．40±0．01 100．6±2．2 16．3±0．6 18．9 86．0±2．2 2．00 2．01±0．02 100．5±1．7 80．4±2．4 90．61 88．8±1．2 8．00 7．98±0．05 99．8±4．8 314．7±3．9 361．65 87．06±0．09

表3 丙泊酚药动学参数（±s，n＝10）Tab 3 Pharmacokinetic parameters of propofol（±s，n＝10）

表3 丙泊酚药动学参数（±s，n＝10）Tab 3 Pharmacokinetic parameters of propofol（±s，n＝10）

房室参数±s 房室参数±s t1／2α／min 2．7±0．8 AUC（0－∞）／mg·L－1·min－1144．3±38．9 t1／2β／min 11．1±3．1 K10／L·min－1 0．031±0．005 t1／2γ／min 278．9±63．8 K12／L·min－1 3．7±0．4 V1／L·kg－1 0．355±0．11 K21／L·min－1 0．065±0．022 CL／L·min－1·kg－1 0．011±0．003 K31／L·min－1 0．054±0．022 AUC（0－120 min）／mg·L－1·min－1 78．5±18．9 K13／L·min－1 0．022±0．005

丙泊酚药动学国外文献常用模型有二室模型［5］和三室模型［6］。国人丙泊酚的药动学基本表现为三室模型［7－8］，这可能与种族差异有关。笔者通过拟合后，发现三室模型时AIC值更小，并且R2更接近于1，表明三室模型更恰当。体现出丙泊酚具有分布广泛，消除率高，起效快，分布消除迅速，再分布缓慢的特点。本实验求的药动学参数除t1／2β（11．076±3．057）min小于与王长连等［7］报道的青年组t1／2β（23±6）min外，其他参数基本相近，可能与他们合并芬太尼的用药有关，芬太尼可能具有干扰丙泊酚消除代谢的特点。而与夏东亚等［8］报道的药动学参数存在一定的差异。笔者认为：这可能与注射剂量、年龄以及阿托品合并用药的影响有一定的关联，随着年龄的增大，其肝、肾功能均具有不同程度的减弱，这可能使丙泊酚的代谢有相应地减慢。

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