唐草片对注射氢化可的松小鼠的免疫保护作用

吴鑫磊，郭玉忠，范磊，王新丽，王宁 （．郑州大学临床药理研究所，河南 郑州45005；．河南省医药科学研究院，河南 郑州45005）

唐草片（Tangcaopian）是我国目前唯一获得国家食品药品监督管理局颁发新药证书、并获准上市的治疗艾滋病的纯中药制剂［1］。唐草片是由老鹳草、金银花、瓜蒌皮等20余味精选中药材制成的中药制剂。唐草片临床治疗艾滋病的结果显示其可以提高患者CD4＋T细胞数量，有效改善艾滋病患者的腹泻、失眠等临床症状，提高患者生活质量，增强其抗病毒能力，在延缓病情进展的同时能够减少化学药物的毒副作用［2］。本实验通过观察唐草片对小鼠免疫系统的作用，探讨唐草片的作用机制，为临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1．1 药物及试剂 唐草片（上海百岁行药业有限公司，批号100901）；氢化可的松（金耀氨基酸有限公司，批 号 H12020887）；IFN－γ ELISA Kit、IL－2 ELISA Kit（美国RD公司）；CD4抗体、CD8抗体、IgG抗体（美国SANTA CRUZ公司）。

1．2 动物 SPF级BALB／C雄性小鼠，6周龄，体质量（20±2）g，购自河南省实验动物中心，合格证号：SCXX（豫）2010－0002。自由摄食和饮水。

1．3 分组与给药 60只小白鼠随机分成6组，每组10只，分别为正常对照组、氢化可的松模型组、香菇菌多糖阳性对照组、唐草片低剂量组（0．5 g·kg－1）、唐草片中剂量组（1．0g·kg－1）、唐草片高剂量组（2．0g·kg－1）。其中唐草片中剂量为临床用药的等效剂量，“唐草片”按照临床用药量9．6 g／人／天，按照小白鼠与人的等效计量进行换算，即人（70 kg）与小白鼠（20 g）体表面积（0．0026）。

所有小鼠按照每天0．1 mL／10 g的剂量灌胃3周，唐草片低（0．5 g·kg－1）、中（1．0g·kg－1）、高（2．0g·kg－1）3个剂量组灌服相应浓度的唐草片，阳性对照组灌服香菇菌多糖片（0．4 mg·kg－1），正常对照组、模型对照组都灌服纯净水。2周后除正常组外每组动物均腹腔注射氢化可的松（25 mg·kg－1体质量），连续1周，正常对照组腹腔注射生理盐水。

1．4 测定指标 末次给药6 h后，每只小鼠眼眶取血适当稀释后利用全自动全血检测仪检测外周血细胞数。小鼠碳廓清功能指标、脏器指数的测定参照文献［3］，按照下述公式计算吞噬指数（K）：K＝（lgA1－lgA2）／（t2－t1），其中A1、A2分别代表两次所采血样的吸光度，t2－t1代表两次采血的时间间隔（8 min）。脏器指数（mg·g－1）＝脏器质量／小鼠体质量。血清中IL－2、IFN－γ含量的测定按照试剂盒使用说明书进行。肠道黏膜中IgA、CD4＋和CD8＋T细胞表达量的测定先进行免疫组织化学染色，然后采用德国Lecia显微照像系统，进行图像采集；利用Image－Proplus 6．0图像分析系统，测定其平均光密度。

1．5 数据分析 结果采用SPSS10．0统计软件进行数据分析，所有数据均用±s表示，采用单因素方差分析（one－way ANOVA）进行多组间均值比较。P＜0．05为有统计学差异。

2 结果

2．1 唐草片对免疫抑制小鼠外周血细胞的影响氢化可的松模型组小鼠白细胞和淋巴细胞的数量与正常组相比，明显减少（P＜0．01）；唐草片中、高剂量组与模型组相比，WBC和LYM计数均明显升高（P＜0．05），其中唐草片中剂量升高最多（P＜0．01），结果见表1。说明唐草片能够升高免疫抑制小鼠外周血中白细胞和淋巴细胞的数量。

表1 唐草片对小鼠外周血细胞计数、免疫器官和碳粒廓清指数的影响（±s，n＝10）Tab 1 Effects of Tangcaopian on peripheral blood cell number，carbon clearance index，thymus and spleen index of mice（±s，n＝10）

表1 唐草片对小鼠外周血细胞计数、免疫器官和碳粒廓清指数的影响（±s，n＝10）Tab 1 Effects of Tangcaopian on peripheral blood cell number，carbon clearance index，thymus and spleen index of mice（±s，n＝10）

注：与正常组比较，aP＜0．05，b P＜0．01；与模型组比较，c P＜0．05，d P＜0．01

组别 白细胞（109·L－1） 淋巴细胞（109·L－1） 脾脏指数（10－3） 胸腺指数（10－5） 吞噬指数（10－3）正常组 4．91±0．38 4．45±0．33 4．54±0．26 75．40±7．81 14．80±2．08 HC模型组 2．25±0．38b 2．14±0．33 b 3．45±0．097a 11．03±1．48b 9．12±0．73a香菇菌多糖组 3．23±0．13bc 3．01±0．13bc 4．4±0．46c 24．21±2．32bc 12．19±1．86唐草片低剂量 2．51±0．16b 2．72±0．13 b 3．6±0．22a 22．71±2．32b 8．27±1．39a唐草片中剂量 3．80±0．59ad 3．27±0．50bd 5．19±0．32d 34．49±6．40bd 14．87±3．56c唐草片高剂量 3．32±0．16bc 3．06±0．19bc 3．78±0．26 25．03±3．35bc 8．31±1．16a

表2 唐草片对小鼠血清中细胞因子和空肠中IgA、CD4＋及CD8＋平均光密度的影响（±s，n＝10）Tab 2 Effects of Tangcaopian on serum IL－2，IFN and intestinal IgA，CD4＋and CD8＋T cells’expression（±s，n＝10）

表2 唐草片对小鼠血清中细胞因子和空肠中IgA、CD4＋及CD8＋平均光密度的影响（±s，n＝10）Tab 2 Effects of Tangcaopian on serum IL－2，IFN and intestinal IgA，CD4＋and CD8＋T cells’expression（±s，n＝10）

注：与正常组比较，aP＜0．05，b P＜0．01；与模型组比较，c P＜0．05，d P＜0．01

组别 IL－2（pg·ml－1） INF－γ（ng·ml－1） IgA（10－3） CD4＋（10－3） CD8＋（10－3）正常组 207．5±14．33 220．74±10．37 461．8±8．05 370．0±7．96 397．9±8．79 HC模型组 165．7±10．65a 182．2±7．16b 331．4±5．64a 219．3±7．84a 278．2±14．57a香菇菌多糖组 190．9±12．88 210．05±8．66c 383．6±9．64ac 301．0±13．4c 353．2±9．99ac唐草片低剂量 167．4±6．22a 183．6±6．87b 360．4±9．38a 236．9±8．75a 308．2±14．57a唐草片中剂量 193．5±13．03c 210．9±9．60c 452．8±4．81c 335．1±8．38c 385．4±10．17c唐草片高剂量 173．8±5．67a 195．4±6．680a 376．8±12．47ac 307．5±10．4ac 323．3±9．84ac

2．2 唐草片对免疫抑制小鼠免疫器官和碳粒廓清指数的影响 氢化可的松模型组小鼠脾脏指数和胸腺指数与正常组相比，明显降低（P＜0．01）；唐草片中、高剂量组脏器指数均明显升高（P＜0．05），其中唐草片中剂量升高明显（P＜0．01）。与模型组吞噬指数相比，只有唐草片中剂量组有显著升高作用（P＜0．05），提示唐草片能够促进免疫器官功能的恢复。结果见表1。

2．3 唐草片对免疫抑制小鼠血清中Th1型细胞因子含量的影响 氢化可的松模型组小鼠IL－2和IFN－γ的水平与正常组比较，明显降低（P＜0．01）；唐草片中剂量组与模型组相比明显升高（P＜0．05），说明唐草片能够增加免疫抑制小鼠血液中Th1型细胞因子的分泌。结果见表2。

2．4 唐草片对免疫抑制小鼠空肠中IgA、CD4＋及CD8＋T细胞表达量的影响 免疫组化实验结果显示，氢化可的松能够降低小鼠肠道IgA、CD4＋及CD8＋T细胞的表达（P＜0．05），而唐草片中、高剂量组IgA、CD4＋及CD8＋T细胞的表达量均高于模型组（P＜0．05），说明唐草片能够提高免疫抑制小鼠肠道IgA、CD4＋及CD8＋T细胞的表达量，增强肠道免疫功能。结果见表2。

3 讨论

唐草片治疗艾滋病的机制之一可能与此类似，即通过减少免疫器官的损害或／和促进免疫器官的修复和功能的恢复而实现的。唐草片提高免疫抑制小鼠血清中的IL－2和INF－γ的水平，提示具有增强细胞免疫的作用。在艾滋病患者体内免疫平衡被打破，细胞免疫严重缺损，标志之一就是Th1型细胞因子（IL－2、INF－γ等）分泌大大减少［4］。因此，唐草片促进Th1型细胞因子分泌、增强细胞免疫功能的作用在艾滋病治疗中可能具有重要意义。

肠黏膜免疫系统在机体内担负着重要的局部防御作用。在HIV感染者体内肠道黏膜是CD4＋T淋巴细胞删除的主要场所，由于免疫功能的逐渐破坏也成为继发感染的根源［5］。分泌型IgA（SIgA）是肠黏膜主要的免疫球蛋白，对粘膜固有的和入侵的病原体具有抵抗作用。本研究研究发现唐草片可以促进肠黏膜IgA的分泌，增加淋巴细胞的数量，可能增强细胞免疫功能，从而改善肠道的屏障作用和免疫功能。这也可能是唐草片能够有效改善如腹泻、食欲不振等临床症状的作用机制之一。

唐草片中剂量是临床用药的等效剂量，实验结果显示，唐草片中剂量组与模型组有差异性，明显提高了氢化可的松造成免疫抑制小鼠外周血淋巴细胞和白细胞的数量、胸腺指数、脾脏指数以及碳廓清指数，说明该药能提高免疫抑制小鼠机体的免疫功能；有些指标与正常组表现出差异性，明显低于正常值。分析其原因在于：唐草片临床用药时间为6个月，本实验时间为3周，猜测如果能够延长用药时间，相应指标的测定值会接近正常值，有待进一步验证。

本研究发现唐草片能够增加机体免疫细胞的数量和功能，其机制可能和促进免疫细胞产生和分化或／和减少免疫细胞的破坏有关，值得深入研究。

［1］中国中医药信息杂志社．中成药“唐草片”获得批准用于改善艾滋病症状［J］．中国中医药信息杂志，2004，11（5）：466．

［2］殷建华，吴剑，杨克宗，等．抗艾滋病中成药唐草片抗氧化性的研究［J］．中国现代中药，2009，11（12）：38－39．

［3］张华，张爽，蔡亚平，等．羊胎盘肽对小鼠非特异性免疫功能的影响［J］．中国生化药物杂志，2007，28（4）：266－268．

［4］Kedzierska K，Crowe SM．Cytokines and HIV－1：interactions and clinical implications［J］．Antivir Chem Chemother，2001，12（3）：133－150．

［5］Mehandru S，Poles MA，Tenner－RaczK，etal．Mechanisms of gastro intestinal CD4＋T－cell depletion during acute and early human immunodeficiency virus type 1 infection［J］．J Viro，2007，81（2）：599－612．