热毒宁注射液的解热抗炎作用及其机制

王开富，萧伟，王振中，徐丽君，毕宇安，孙兰，邹欣，龚菂，黄光英 （．华中科技大学同济医学院附属同济医院，湖北 武汉430030；2．江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港22200；3．中药制药过程新技术国家重点实验室，江苏 连云港22200）

热毒宁注射液是由青蒿、金银花、栀子等中药合理配伍而成的纯中药注射液，在临床中已广泛应用，且并未见明显毒副作用和不良反应［1－2］，为对热毒宁注射液抗炎、解热作用及其机制进行全面的评价，进一步推广临床应用，本实验对其进行了系统研究。

1 材料

热毒宁注射液（江苏康缘药业公司，批号20100728，规格：10 mL／支）；双黄连粉针剂（哈药集团中药二厂，批号1004202，规格：600 mg／支）；赖氨酸阿斯匹林（也称来比林）粉针剂（蚌埠丰原涂山制药有限公司，批号091117，规格：0．9 g／支）；无热源水（细菌内毒素检测用水，湛江安度斯生物有限公司）；无菌生理盐水（武汉双鹤药业公司）；无菌注射用水（天津药业集团新郑股份有限公司）；细菌内毒素工作标准品（冻干粉剂）购置中国食品药品检定研究院（批号150601，规格：160EU／支）；IL－1、IL－6、ET－1试剂盒由北方生物所提供；PGE2由北京华英生物技术研究所检测。

日本大耳白兔，60只，雌雄各半，体质量1．8～2．5 kg，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供［SCXK（鄂）2008－0006］；Wistar大鼠，60只，雌雄各半，体质量150～160 g，华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK（鄂）2008－0005；昆明小鼠，雌雄各半，100只，体质量25～30 g，华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK（鄂）2004－0007。

2 方法

2．1 热毒宁清热解毒的功效及机制

2．1．1 试剂及药物配制 大肠杆菌内毒素（家兔发热模型用药品）冻干品160 Eu／支，用无菌注射用水溶解并稀释至5．3 mL则为30．1 Eu·mL－1放置混悬器上振荡15 min，家兔造模用剂量15 Eu·kg－1；

热毒宁注射液稀释：将欲盛装药液的玻璃瓶放置180℃烤箱中干烤2 h冷却后备用，在无菌环境下，按上述低、中、高3个剂量将热毒宁注射液分装于干烤后的玻璃瓶中备用；双黄连注射液配制：将冻干粉针剂（600 mg／支）的双黄连用无热源注射用水溶解并稀释至6．85 mL则为87．6 mg·mL－1，家兔按2 mL·kg－1注射。

2．1．2 实验步骤与方法 健康合格家兔60只，适应性饲养3 d后动物分组。将动物随机分为6组：正常对照组，模型组，双黄连治疗组，热毒宁注射液（5．08，2．54，1．27 g·kg－1）3个剂量治疗组，每组10只。热毒宁注射液、双黄连注射液治疗组均按设计剂量于兔耳静脉注射给药，正常对照组、模型组均用生理盐水注射，连续3 d。

用细菌内毒素制作家兔发热模型，将健康动物连续3次测量体温在38．5～39．6℃选为合格动物，于药物治疗的第3天，按15 Eu／kg于家兔耳静脉注射细菌内毒素，注射内毒素后体温升高0．5～0．8℃以上者为发热模型动物［3］，且同时再次给药治疗，并在注射内毒素后1，2，4 h 3次测量发热家兔肛温值；以温差值计算并比较用药前后肛温值的变化；于注射内毒素后4 h处死家兔分离血清及血浆分别检测IL－1、IL－6、PGE2、ET－1等指标。其中：肛温差值（即肛温Δ值）＝1 h，2 h，4 h肛温值－基础肛温值。

2．2 热毒宁注射液对角叉菜胶致大鼠炎症的抑制作用及机制

2．2．1 试剂及药物配制 来比林注射液的配制：将冻干粉针剂（0．9 g／支）的来比林用4．46 mL无热源注射用水溶解，再按1∶2稀释，用于大鼠尾静脉注射；配制1%角叉菜胶混悬液：称取角叉菜胶1 g，混悬于100 mL生理盐水中，置于冰箱中放置24 h，备用。

2．2．2 实验步骤与方法 健康 Wistar大鼠60只，雌雄各半，适应性饲养3 d。随机分成5组（每组10只），即模型组、来比林组（262．5 mg·kg－1），热毒宁注射液（10．15，5．08，2．54 g·kg－1）3个剂量组，另10只设为正常对照组，（用于检测IL－1、IL－6）。每日静脉给药一次，注射速度为0．2 mL·min－1，连续3 d，模型组给予等体积的生理盐水。末次给药15 min，在大鼠足跖皮下注射1%角叉菜胶混悬液0．10 mL致炎［2］，用毛细管放大测量装置测量致炎前后大白鼠足跖关节以下的容积，计算并比较致炎后1，2，3，4 h各组的平均肿胀度和抑制率（注：抑制率＞30%，并经统计学处理有显著差异者，可认为该剂量具有抗炎苗头）；4 h腹主动脉取血，检测IL－1、IL－6。

肿胀度＝致炎后足趾关节以下的容积－致炎前足趾关节以下的容积

抑制率＝（对照组平均肿胀度－给药组平均肿胀度）／对照组平均肿胀度

2．3 热毒宁注射液对二甲苯致小鼠耳肿炎症的抑制作用

2．3．1 药物配制 来比林的配制：将冻干粉针剂（0．25 g／支）的来比林用3．8 mL无热源注射用水溶解并稀释，用于小鼠尾静脉注射。

2．3．2 实验步骤与方法 小鼠50只，雌雄各半，适应性饲养3 d。随机分成5组：对照组、来比林组（525 mg·kg－1）、热毒宁注射液（20．30，10．15，5．08 g·kg－1）3个剂量组。每日静脉给药一次，对照组给予等体积的生理盐水，注射速度为0．2 mL·min－1，连续3 d，末次给药15 min后，将二甲苯30μL，均匀涂于右耳正反两面，以左耳作对照，30 min后颈椎脱臼处死动物，剪下两耳，用6 mm打孔器将小鼠双耳同部位打孔取材，分别精密称重，以两耳片质量差值作为肿胀程度指标，计算肿胀度［3］，并求出抑制率比较药物组和对照组间的差异。

肿胀度＝右耳取材质量－左耳取材质量

肿胀率＝（右耳取材质量－左耳取材质量）／左耳取材质量×100%

2．4 热毒宁注射液对小鼠毛细血管通透性的影响

2．4．1 试剂配制 配制1%伊文思兰溶液。

2．4．2 实验步骤与方法 小鼠50只，雌雄各半，适应性饲养3 d。随机分成5组：对照组，来比林组（0．2 g·kg－1），热毒宁注射液（20．30，10．15，5．08 g·kg－1）3个剂量组。每日静脉给药一次，对照组给予等体积的生理盐水，注射速度为0．2 mL·min－1，连续3 d。末次给药15 min后，腹腔注射0．5%冰醋酸0．2 mL，同时尾静脉注射1%伊文思兰0．2 mL。30 min后将颈椎脱臼处死动物，腹腔注入5 mL纯化水，轻揉腹部数秒钟，于腹壁上剪一小口，用吸管吸取腹腔内液体，590 nm处比色，测定OD值［3］。

2．5 统计学方法 采用SAS软件进行成组设计资料的t检验。

3 结果

3．1 热毒宁注射液对家兔肛温值的影响 注射内毒素后家兔肛温明显上升，1，2，4 h家兔肛温值减基础肛温值（肛温Δ值）的变化如图1。注射内毒素1 h各组肛温值明显升高，与正常组比较均有显著性差异，表明发热模型制作成功。伴随药物治疗，热毒宁高、中剂量组均具有明显清热、降体温的作用，于注内毒素2 h肛温值下降显著，与模型组比较具有显著性意义（P＜0．01）。

图1 时间－温度曲线Fig 1 Time vs temperature curves

3．2 热毒宁注射液对家兔白细胞介素1（IL－1）、白细胞介素6（IL－6）、内皮素（ET－1）、前列腺素 E2（PGE2）的影响 家兔感染内毒素后，IL－1、IL－6、ET－1、PGE2明显升高，与正常组比较，模型组差异具有显著性（P＜0．05）；热毒宁注射液对IL－1、IL－6、ET－1、PGE2均有明显抑制作用，见表1。

3．3 热毒宁注射液对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀度及抑制率的影响 由结果可知：热毒宁注射液高、中剂量组对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀均有明显抑制作用，1 h开始显效，持续至4 h；低剂量组在2 h方开始显效，抑制作用可持续至4 h。见表2。

3．4 热毒宁注射液对角叉菜胶致大鼠炎症介质的影响 结果表明，热毒宁注射液高、中剂量组对角叉菜胶致大鼠炎症介质IL－1有明显的抑制作用；高、中、低3个剂量组对角叉菜胶致大鼠炎症介质IL－6均有明显的抑制作用，与模型组比较差异有显著性（P＜0．05），见表3。

3．5 热毒宁注射液对二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制作用；对小鼠毛细血管通透性的影响 结果可知，热毒宁注射液高剂量组对二甲苯致小鼠耳肿胀有抑制作用；能明显降低小鼠毛细血管通透性（P＜0．05），见表4。

表1 热毒宁对家兔IL－1、IL－6、ET－1、PGE2的影响（±s，n＝10）Tab 1 Effects of Reduning injection on the levels of IL－1，IL－6，ET－1，PGE2in rabbits（±s，n＝10）

表1 热毒宁对家兔IL－1、IL－6、ET－1、PGE2的影响（±s，n＝10）Tab 1 Effects of Reduning injection on the levels of IL－1，IL－6，ET－1，PGE2in rabbits（±s，n＝10）

注：与正常对照组比较，aP＜0．05，b P＜0．01；与模型组比较，c P＜0．05，d P＜0．01

组别 IL－1／ng·mL－1 IL－6／pg·mL－1 ET－1／pg·mL－1 PGE2／pg·mL－1正常组 5．6±2．6c 34 087．9±14 377．7 1 073．5±332．9c 33．7±2．2c模型组 8．1±3．0a 44 231．7±15 689．1a 1 410．3±324．5b 38．7±5．8a双黄连组 6．4±4．7 37 588．8±13 225．1 905．4±510．3c 37．5±2．8a低剂量组 6．9±3．4 47 221．3±22 297．9a 1 137．9±313．1 34．7±2．5c中剂量组 7．6±2．5 37 692．5±13 085．1 1 207．7±287．9 36．3±2．7a高剂量组 4．9±2．2c 28 717．4±8 286．3ad 736．3±336．1d 35．1±3．8

表2 大鼠足跖肿胀度及抑制率（±s，n＝10）Tab 2 The rat paw swelling degree and inhibitory rate（±s，n＝10）

表2 大鼠足跖肿胀度及抑制率（±s，n＝10）Tab 2 The rat paw swelling degree and inhibitory rate（±s，n＝10）

注：与模型组比较，aP＜0．05

时间 指标 模型组（生理盐水）来比林组（0．1 g·kg－1）高剂量组（10．15 g·kg－1）中剂量组（5．08 g·kg－1）低剂量组（2．54 g·kg－1）a 1 h 肿胀度／mL 0．71±0．09 0．16±0．08a 0．18±0．12a 0．37±0．08a 0．56±0．11抑制率／% 77．03 74．37 48．88 21．85 2 h 肿胀度／mL 1．21±0．12 0．35±0．14a 0．44±0．18a 0．66±0．16a 0．82±0．16a抑制率／% 71．24 63．80 45．78 32．15 3 h 肿胀度／mL 1．32±0．07 0．25±0．18a 0．53±0．19a 0．70±0．22a 0．88±0．19a抑制率／% 81．42 59．97 47．13 33．61 4 h 肿胀度／mL 1．34±0．16 0．21±0．14a 0．46±0．15a 0．62±0．24a 0．79±0．19a抑制率／% 84．23 65．92 53．87 41．15

表3 热毒宁注射液对大鼠血清IL－1、IL－6的影响（±s，n＝10）Tab 3 Effects of Reduning injection on the levels of serum IL－1，IL－6 in rats（±s，n＝10）

表3 热毒宁注射液对大鼠血清IL－1、IL－6的影响（±s，n＝10）Tab 3 Effects of Reduning injection on the levels of serum IL－1，IL－6 in rats（±s，n＝10）

注：与正常对照组比较，aP＜0．05；与模型组比较，b P＜0．05

组别 IL－1／ng·mL－1 IL－6／pg·mL－1正常组 0．06±0．03b 34．5±11．4b模型组 0．118±0．020a 194．4±94．5a来比林组 0．06±0．035b 38．4±13．9b低剂量组 0．068±0．016 33．3±10．1b中剂量组 0．06±0．04b 36．7±18．8b高剂量组 0．045±0．020b 34．3±9．4b

表4 热毒宁对小鼠耳肿胀度、肿胀率、毛细血管通透性的影响（±s，n＝10）Tab 4 Effects of Reduning injection on the mouse ear swelling degree，rate of swelling and capillary permeability of mice（±s，n＝10）

表4 热毒宁对小鼠耳肿胀度、肿胀率、毛细血管通透性的影响（±s，n＝10）Tab 4 Effects of Reduning injection on the mouse ear swelling degree，rate of swelling and capillary permeability of mice（±s，n＝10）

注：与对照组比较，aP＜0．05

组别 肿胀度／mg肿胀率／%毛细血管通透性（OD值）对照组 14．8±3．5 1．2±0．3 1．1±0．4来比林组 7．3±4．0a 0．6±0．3a 0．31±0．09a低剂量组 11．2±5．5 0．9±0．4a 1．3±0．5中剂量组 16．4±5．5 1．3±0．4 0．8±0．5高剂量组 7．2±5．3a 0．6±0．4a 0．54±0．18a

4 讨论

本研究给家兔注入大肠杆菌内毒素（LPS）1 h，模型组肛温急剧上升，继而出现拒食、嗜睡、寒战、气急、精神萎靡等一系列内毒素中毒症状（类似上呼吸道感染）；血清中IL－1、IL－6、ET－1和 PGE2水平明显增高。上呼吸道感染主要由病毒及细菌所引起，这些外源性致热源（细菌、病毒、内毒素等），作用于人体细胞产生内源性致热源，内源性致热原产生PGE2作用于下丘脑，从而引起发热，内源性致热因子主要包括IL－1、IL－6、TNF－α、IFN－γ，IL－6是由单核／巨噬细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞及淋巴细胞等细胞产生，具有多种功能的重要促炎因子，在细胞因子网络中发挥多种生物学作用，在上呼吸道感染中是重要促炎因子，不仅有致发热的作用而且诱导了细胞的增殖分化产生免疫球蛋白［4］。

经热毒宁治疗后，动物上述中毒表现和炎性细胞因子的升高以及血管活性介质的失衡均得到明显地控制与改善；家兔肛温明显下降，对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀有明显抑制作用，1 h开始显效，可持续至4 h；大鼠血清IL－1、IL－6水平显著下降，并对二甲苯致小鼠耳肿胀有较强的抑制作用，使小鼠毛细血管通透性降低，结果表明热毒宁具有较强的抗炎解热作用。

热毒宁注射液是国家二类新药，注射液有效成份为青蒿、金银花、栀子。青蒿：味苦、辛、性寒，辛以解表、寒以清热，故能透散风热，邪毒从肌表而解；金银花：银花味甘、性寒，功能清热解毒，助君药青蒿以增强其清热及透散之功，在方中为臣药；而栀子苦寒，具有清热解毒，凉血及泻火除烦之功，为佐药，助臣药金银花解毒。

研究表明红肿热痛以及脓毒血症是感染性炎症病理过程反映的主要症状，它是由大量炎性细胞产生的介质参与的复杂现象，其中主要是炎性细胞因子的作用［5］。LPS和角叉菜胶都能激活单核细胞／巨噬细胞分泌大量炎性细胞因子，如TNF、IL－1、IL－6等引起炎症反应［5－7］，IL－1可选择性通过血脑屏障，通过温度调节中枢释放PGE2而引起发热；IL－1、IL－6均有促炎症作用［8］。本研究采用 LPS和角叉菜胶制模后动物出现体温升高、足趾肿胀、致炎因子增加等一系列炎症反应，与文献报道十分吻合。

不论何种性质的炎症，炎症介质在炎症产生的全过程中均起着非常重要的作用。PGE2是花生四烯酸经COX代谢产生的炎症介质，能扩张细动脉血管，增加组胺、升高血管壁通透性的作用，促进炎性渗出，介导局部炎症应答，引起水肿，所以在炎症组织中PGE2含量越多，表明炎症程度越重［9］。本实验家兔受内毒素攻击后血中PGE2水平明显增高，模型组显著高于其他组（P＜0．05），治疗组显著低于模型组（P＜0．05）。

热毒宁对动物血清IL－1、IL－6、PGE2具有明显抑制作用，使家兔体温下降、大鼠足趾肿胀、小鼠耳郭肿胀及毛细血管通透性均得到明显的改善或控制，因此认为热毒宁注射液具有较强的抗炎、解热作用，其机制可能与拮抗IL－1、ET－1、IL－6、PGE2等炎性介质调节内源性至热源有密切关系。

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