阿司匹林对大鼠醋酸胃溃疡愈合的影响

王国忠，肖薇，李波 （齐齐哈尔医学院病理生理教研室，黑龙江 齐齐哈尔161006）

阿司匹林（aspirin，Asp）是解热、消炎、镇痛和治疗风湿的标准药物，国内外文献报道Asp还可治疗动脉硬化、癌症、老年痴呆［1］。Asp还有预防心脑血管疾病的作用［2］。Asp药理作用如此广泛，以至于该药用药频度（DDDs）排序名列前茅［1］。但是，Asp有损伤胃肠道的不良反应：Asp通过抑制环加氧酶活性，减少前列腺素E2的生成，使胃酸分泌增多，加重溃疡［3］；通过促进胃泌素的表达使胃酸分泌增多抑制溃疡愈合［4］，还可通过抑制表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）的表达抑制溃疡愈合［5］。对于Asp引起胃肠道溃疡的机制还不完全清楚［6］。EGF与 TGF－α有35%的序列同源性，并且结合同一受体［7］。Asp是否也能通过抑制TGF－α的表达来抑制溃疡愈合以及通过其他机制影响溃疡愈合呢？目前还不清楚。为此，该项研究探讨了Asp对转化生长因子－α（transforming grouth factor－α，TGF－α）、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、胃黏液和胃黏膜血流（gastric macosal blood flow，GMBF）的影响，进而探讨对溃疡愈合的影响及机制。这对进一步阐明Asp的药理作用和不良反应，在临床上合理应用Asp，保护人们的健康具有重要意义。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 仪器 奥林巴斯光学显微镜、Motic Med 6．0数码医学图像分析系统、LRH－250－A型生化培养箱为日本产品。ML191型激光多谱勒血流仪为澳大利亚产品。RM2015型Leica切片机为德国产品。

1．1．2 试剂 阿司匹林为美国Alfa Aesar公司产品（货号为a12488）。TGF－α兔抗鼠一抗（货号为bs－0066R）和PCNA兔抗鼠一抗（货号为bs－2007R）为北京博奥森生物技术有限公司产品，购于北京赛诺科为生物有限公司，其山羊抗兔辣根过氧化物酶标二抗（货号为CW0103）以及DAB显色试剂盒（货号为CW0125，批号17909F）为康为世纪生物科技有限公司产品，购于北京赛诺科为生物有限公司。阿尓新蓝为中国上海化学试剂厂产品（批号20080612）。

1．1．3 实验动物 清洁级 Wistar大鼠，♂，体质量200～220 g，购于大连医科大学实验动物中心。许可证号：SCXK（辽）2008－0002。

1．2 方法

1．2．1 溃疡模型复制及分组 按先前报道的方法［3］复制大鼠醋酸溃疡模型并分组，简述如下：乙醚麻醉大鼠，剑突下腹正中切口，开腹后将胃拉出，将内径6 mm的塑料管紧贴于胃体与幽门交界处，向管内注入99．5%（V／V）的醋酸75μL，25 s后移除醋酸，将胃放回腹腔，依次缝合腹壁，第3天即出现典型的消化性溃疡结构。8 d后随机分为如下3组：模型对照组，在8～15 d每天禁食5 h；盐水组对照，在8～15 d每天禁食4 h后用灌胃法给予生理盐水，然后再禁食1 h；阿司匹林组，在8～15 d每天禁食4 h后用灌胃法给予阿司匹林50 mg·kg－1体质量，然后再禁食1 h。在模型复制的第16天收集标本进行指标检测。

1．2．2 TGF－α和PCNA表达的检测 用免疫组化Elivison二步法检测TGF－α和PCNA在胃黏膜中的表达，简述如下：4%福尔马林固定接触醋酸部位的胃黏膜标本，石蜡包埋、做4μm厚切片、烘片，脱蜡至水，抗原修复，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，滴加一抗，TGF－α一抗稀释比为1∶200，PCNA一抗稀释比为1∶200，4℃水箱过夜，滴加二抗，稀释比为1∶500，37℃温箱孵育1 h，DAB显色，苏木素复染，0．1%HCl分化，蓝化，脱水透明，封固。TGF－α和PCNA在光镜下显示为棕色。每组8只大鼠随机取4只大鼠胃做标本，每个标本取1张切片，每张切片随机取2个视野，然后用 Motic Med 6．0数码医学图像分析系统检测溃疡边缘TGF－α和PCNA的积分光密度。

1．2．3 胃黏液的检测 采用Schiff－阿尓新蓝染色法，其方法简述如下：溃疡边缘组织切片到水，阿尓新蓝染色，Schiff试剂染色，1%盐酸酒精分化，常规脱水，二甲苯透明，封片。中性胃黏液染成红色，酸性胃黏液染成蓝色，然后用Motic Med 6．0数码医学图像分析系统检测溃疡边缘中性和酸性胃黏液，二者之和作为胃黏液的积分光密度。

1．2．4 溃疡边缘胃黏膜血流的检测 在溃疡边缘选出3点放置激光多普勒血流仪测定探头进行测定，取均值，血流量单位以多普勒信号的电压值（mV）表示。

1．3 统计学分析 计量数据用±s表示，用SPSS 18．0统计分析软件进行分析，组间差异采用单因素方差分析中的最小显著差法（LSD）进行分析，P＜0．05为差异显著，P＜0．01为差异非常显著。

2 结果

2．1 各组溃疡边缘TGF－α、PCNA表达和胃黏液分泌的差异 图1显示用免疫组化方法检测TGF－α在溃疡边缘胃黏膜中的表达，棕色为TGF－α染色，由图1可见，模型对照组和盐水对照组TGF－α表达量相似，较阿司匹林组多。

图1 阿司匹林对胃黏膜TGF－α表达的影响（×400）Fig 1 Effects of aspirin on expression of TGF－αin gastric mucosa（×400）

图2显示用免疫组化方法检测PCNA在溃疡边缘胃黏膜中的表达，棕色为PCNA染色，由图2可见，模型对照组和盐水对照组PCNA表达量相似，较阿司匹林组多。

图2 阿司匹林对胃黏膜PCNA表达的影响（×400）Fig 2 Effects of aspirin on expression of PCNA in gastric mucosa（×400）

图3显示溃疡边缘胃组织Schiff－阿尓新蓝染色，中性胃黏液染成红色，酸性胃黏液染成蓝色，由图3可见，模型对照组和盐水对照组胃黏液量相似，较阿司匹林组多。

图3 阿司匹林对胃黏液的影响（×100）Fig 3 Effects of aspirin on gastric mucus（×100）

2．2 各组溃疡边缘TGF－α、PCNA、胃黏液的积分光密度差异 结果见表1。

表1 各组TGF－α、PCNA和胃黏液积分光密度的差异（±s，n＝8）Tab 1 Difference of the integral light density of TGF－α，PCNA and gastric mucus in each group（±s，n＝8）

表1 各组TGF－α、PCNA和胃黏液积分光密度的差异（±s，n＝8）Tab 1 Difference of the integral light density of TGF－α，PCNA and gastric mucus in each group（±s，n＝8）

注：与阿司匹林组比较，aP＜0．01，b P＜0．05

组别 TGF－α PCNA 胃黏液模型对照组 12．0±3．0a 18．5±3．7a 20．9±3．2b盐水对照组 12．7±2．62a 19．2±3．4a 21．0±2．8b阿司匹林组 8．1±2．4 13．0±2．7 16．4±4．9

2．3 各组溃疡边缘GMBF的差异 结果见图4。

图4 阿司匹林对胃黏膜血流的影响Fig 4 Effects of aspirin on GMBF

3 讨论

先前报道［3］，模型对照组、盐水对照组、阿司匹林组在模型复制的第16天，溃疡面积分别为（8．6±3．0），（9．2±2．5），（12．0±2．6）mm2，阿司匹林组与模型对照组、盐水对照组相比，P＜0．05，模型对照组与盐水对照组相比无统计差异。表明阿司匹林能够延迟溃疡愈合。

胃组织能够分泌TGF－α，它作用于EGF受体，控制细胞增殖、分化和迁移，加速损伤上皮的修复［8］。从实验结果图1来看，溃疡边缘TGF－α在模型对照组和盐水对照组表达基本相同，而阿司匹林组减少；TGF－α的积分光密度在模型对照组和盐水对照组无显著差异，而Asp组与模型对照组和盐水对照组相比有非常显著差异（P＜0．01，见表1），表明Asp有抑制TGF－α表达，阻碍损伤的胃黏膜上皮的修复，进而抑制了溃疡的愈合。

PCNA是一种相对分子质量为36 kDa核蛋白，是DNA聚合酶的辅助蛋白，在细胞周期的S期高表达，是反映细胞增殖活性的重要生物学指标［9］。胃黏膜细胞是体内细胞更新最快的细胞之一，以维持黏膜屏障的作用。从实验结果图2来看，PCNA在模型对照组、盐水对照组表达基本相同，而阿司匹林组减少；PCNA的积分光密度在模型对照组和盐水对照组无显著差异，而Asp组与模型对照组和盐水对照组相比有非常显著差异（P＜0．01，见表1），表明Asp抑制PCNA的表达，从而抑制了胃黏膜细胞的增殖、更新，进而抑制了溃疡的愈合。

胃黏膜细胞分泌的胃黏液附着在胃黏膜表面，是防御有害因子侵袭的第一道防线［10］。从实验结果图3来看，溃疡边缘胃黏液在模型对照组和盐水对照组基本相同，而阿司匹林组减少；胃黏液的积分光密度在模型对照组和盐水对照组无显著差异，而Asp组与模型对照组和盐水对照组相比有非常显著差异（P＜0．01，见表1），表明Asp也有抑制胃黏液生成的作用，进而也抑制了溃疡的愈合。

GMBF为胃黏膜提供氧和营养物质，维持胃黏膜细胞的更新，是胃黏膜防御有害因子侵袭的重要因素［10］。从实验结果图4来看，溃疡边缘GMBF在模型对照组和盐水对照组基本相同，而阿司匹林组减少；表明Asp有减少GMBF的作用，由此抑制了胃黏膜细胞的更新，进而抑制了溃疡的愈合。

由上述推测，阿司匹林抑制溃疡愈合的机制可能是：阿司匹林通过抑制TGF－α、PCNA的表达和减少GMBF，导致胃黏膜增殖、修复能力降低、胃黏液生成减少，抑制了溃疡的愈合。这些机制在临床上合理应用阿司匹林具有重要意义。为此，长期大剂量应用阿司匹林时，应重视胃黏膜保护药的应用。

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