愈美干混悬剂在健康志愿者体内的生物等效性研究*

隋 淼，袭荣刚，王昕南

(中国人民解放军第210 医院，大连 116021)

愈美干混悬剂由非成瘾性镇咳药物氧去甲右美沙芬与祛痰药愈创木酚甘油醚组成。氧去甲右美沙芬系非依赖性中枢镇咳药，直接抑制延脑咳嗽中枢而发挥镇咳作用，镇咳作用与依赖性中枢镇咳药可待因相似或较强，且不具镇痛或催眠作用，治疗量对呼吸中枢无抑制作用，亦无依赖性和耐受性，起效快，此外尚有阿托品样抗胆碱作用及解除肌肉痉挛作用。愈创木酚甘油醚通过刺激胃黏膜，反射引起支气管分泌增加，有利于痰液稀释及咳出，从而祛痰止咳。两药相组合达到了较强的止咳祛痰作用。

根据国家食品药品监督管理局新药临床试验批文，本研究对大连弘丰药业发展有限公司生产的愈美干混悬剂(受试制剂)与大连美罗大药厂生产的愈美片(参比制剂)进行人体相对生物利用度研究，评价两种制剂的生物等效性。

1 药品与仪器

1.1 制剂 受试制剂:愈美干混悬剂(规格:每袋2 g，含氢溴酸右美沙芬15 mg 和愈创木酚甘油醚0.1 g，批号050801，大连弘丰药业发展有限公司提供)。参比制剂:愈美片(商品名可坦，规格:每片含氢溴酸右美沙芬15 mg 与愈创木酚甘油醚0.1 g，批号20051201，大连美罗大药厂提供)。对照品:氧去甲右美沙芬对照品(含量100%，批号085k4631，由Sigma 公司提供);愈创木酚甘油醚对照品(含量100%，批号100751 -200401，由中国药品生物制品检定所提供);左氧氟沙星对照品(含量97.2%，批号100451 -200501，由中国药品生物制品检定所提供)。乙腈、甲醇为色谱纯;三氯甲烷、异丙醇、磷酸二氢铵、枸橼酸钠、柠檬酸均为分析纯;β - 葡萄糖苷酸酶(Sigma 公司提供，批号041k70321);水为纯净水;空白血浆(由吉林大学第一医院提供)。

1.2 仪器 LC -10ATvp 高效液相色谱仪(日本岛津公司);AgiLent 1200 1321A 荧光检测器(美国安捷伦公司);N2000 色谱数据工作台软件(浙江大学智达信息工程有限公司);TGL -16G 离心机(上海安亭科学仪器厂);XW-80A 微型旋涡混合仪(上海沪西仪器厂有限公司);FA1004 电子天平(上海恒平科学仪器有限公司);分析天平(上海精科天平公司);MTN -2800W氮吹浓缩装置(天津奥特塞恩斯仪器有限公司)。

2 对象和方法

2.1 受试对象20 例男性健康志愿者，年龄(22.25 ±1. 41)岁，体重(66. 35 ± 8. 72)kg，身高(173.55 ±9.57)cm。受试者均无心、肝、肾、代谢异常等病史，无慢性胃肠道疾病，无吸烟、嗜酒等不良嗜好。经全面体检，血、尿常规，肝、肾功能，X 线透视，血压及心电图均无异常发现。所有受试者均被告知试验过程及相关不良反应并签署知情同意书。

2.2 分组与给药 本研究为单剂量给药试验，用两制剂双周期自身对照交叉试验设计。受试者随机分为两组，试验前禁食10 h，试验日晨空腹用200 ml 温开水送服试验制剂4 袋或参比制剂4 片，服药后2 h 内禁水，给药4 h 后给予统一低脂肪、低蛋白标准餐。20 名受试者服药1 周后交叉给药，重复上述试验。服药期间禁烟、酒和含咖啡因类饮料，避免剧烈运动和长时间卧床。试验前2 周至试验期间不服用任何其他药物。

2.3 血样采集 受试者于服药前(0 h)和服药后的0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、5、6、8、12 和24 h 于上肢静脉取血5.0 ml 置于肝素管中;离心(3 500 r/min)10 min分离血浆;置-70 ℃冰箱保存待测。

3 血药浓度测定与方法学评价

3.1 色谱条件 色谱柱:DimanosiL C18柱(200 mm ×4.6 mm，5 μm);预柱:C18保护柱;流动相:甲醇- 乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氢铵(5∶ 17∶ 78，用36%醋酸调解pH 值3. 65 ～3. 70);流速:1. 0 ml/min;柱温:25 ℃;激发波长:280 nm;发射波长:313 nm;进样量:20 μl。

3.2 样品处理

3.2.1 酶解 精密量取血浆250 μl，加入β -葡萄糖苷酸酶溶液(3 000 U/ml)100 μl、0.1 mol/L 枸橼酸钠缓冲溶液100 μl，涡旋30 s，置37 ℃恒温水浴中水解16 h，取出，放冷。

3.2.2 血浆提取 在上述酶解后的血浆样品中，精密加入乙腈50 μl、甲醇50 μl、内标溶液(1.66 mg/ml 左氧氟沙星溶液)50 μl、饱和的碳酸钠溶液200 μl，涡旋30 s;加入三氯甲烷-异丙醇(4∶ 1)3 ml，振荡10 min，10 000 r/min 离心5 min;吸取有机相，在40 ℃水浴中氮气吹干，用100 μl 流动相复溶，移至1.5 ml 离心管中，15 000 r/min 离心5 min，取上清液20 μl 进行分析。

3.3 标准曲线制备 精密量取250 μl 空白血浆，分别加入不同浓度的氧去甲右美沙芬和愈创木酚甘油醚标准溶液各50 μl，分别配制成氧去甲右美沙芬药物浓度为10. 04、20. 08、50. 20、100. 40、200. 80、502. 00、1 004.00、2 008.00、2 510.00 ng/ml 和愈创木酚甘油醚药物浓度为20.06、50.16、100.32、200.64、401.28、1 003.20、1 504.80、2 006.40、2 508.00 ng/ml 的血浆样品，按“3.2”项下方法操作，进行双样本分析，制备氧去甲右美沙芬和愈创木酚甘油醚的标准曲线。以待测物浓度(X，ng/ ml)为横坐标，待测物峰面积比(Y，As/Ai)为纵坐标，用加权最小二乘法(权重系数:1/ X2)进行线性回归运算［1］，求得直线回归方程。氧去甲右美沙芬回归方程为Y = 0.003 85 + 0. 002 69 X (r =0.999 51);愈创木酚甘油醚回归方程为 Y =0.018 22 +0.003 72 X(r =0.999 22)。结果表明，氧去甲右美沙芬在10.04 ～2 510.00 ng/ml 范围内线性关系良好，最低检测浓度为10.04 ng/ml(S/N ＞10);愈创木酚甘油醚在20.06 ～2 508.00 ng/ml 范围内线性关系良好，最低检测浓度为20. 06 ng/ml(S/N ＞10)。

3.4 提取回收率 取空白血浆250 μl，分别精密加入不同浓度的氧去甲右美沙芬和愈创木酚甘油醚标准溶液各50 μl，分别配制成氧去甲右美沙芬药物浓度为20.08、200.80、2 008.00 ng/ml 和愈创木酚甘油醚药物浓度为50.16、401.28、2 006.40 ng/ml 的血浆样品各3份，按“3.2”项下方法操作，获得相应色谱峰面积A;同时另取空白血浆250 μl，除不加标准系列溶液和内标外，按“3.2”项下方法操作，向获得的有机相中加入相应浓度的标准溶液50 μl 和内标溶液50 μl，涡流混合，氮气吹干后用100 μl 流动相复溶，取样20 μl 进行分析，获得相应色谱峰面积A’(三次测定的平均值)。以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算提取回收率。提取回收率为A/A’×100%，结果见表1 和表2。结果表明，氧去甲右美沙芬的低、中、高三个浓度的提取回收率为69.05% ～89.71%，愈创木酚甘油醚的低、中、高三个浓度的提取回收率为72.39% ～87.64%。

3.5 精密度试验 取空白血浆250 μl，再分别加入不同浓度的氧去甲右美沙芬和愈创木酚甘油醚标准溶液各50 μl，分别配制成氧去甲右美沙芬药物浓度为20.08、200.80、2 008.00 ng/ml 和愈创木酚甘油醚药物浓度为50.16、401.28、2 006.40 ng/ml 的血浆样品，按“3.2”项下方法试验，在不同天的时间内连续制备并测定3 个分析批，每批样品分为低、中、高三个浓度水平，每个浓度进行六样本分析，计算日内和日间精密度，数据见表1 和表2。

表1 氧去甲右美沙芬精密度与回收率试验结果

表2 愈创木酚甘油醚精密度与回收率试验结果

3.6 稳定性试验 取250 μl 空白血浆，分别加入不同浓度氧去甲右美沙芬和愈创木酚甘油醚标准溶液各50 μl，分别配制成氧去甲右美沙芬药物浓度为20. 08、200.80、2 008.00 ng/ml 和愈创木酚甘油醚药物浓度为50.16、401.28、2 006.40 ng/ml 的血浆样品，每个浓度各9 份，3 份按“3.2”项下方法试验，在室温放置24 h后进样分析，考查血浆样品在室温条件下的稳定性;3份于-70 ℃冰箱冷冻，反复冻融三次后，按“3.2”项下操作，进样分析，考查血浆样品的反复冻融稳定性;另3份于-70 ℃冷冻保存13 d 后，按“3.2”项下方法操作，进样分析，考查血浆样品在长期冷冻条件下的稳定性。结果显示RSD 均小于15%，表明氧去甲右美沙芬和愈创木酚甘油醚在室温24 h、反复冻融以及长期冷冻条件下稳定性均较好。

3.7 专属性 空白人血浆、对照品血浆样品和受试者血浆样品的色谱图见图1。氧去甲右美沙芬、愈创木酚甘油醚和内标左氧氟沙星分离完全，峰形良好，其保留时间分别为9、12 和6 min。结果表明，血浆中内源性物质不干扰氧去甲右美沙芬、愈创木酚甘油醚和内标的测定。

图1 空白血浆(A)对照品+空白血浆(B)血浆样品(C)HPLC 色谱图

3.8 数据处理 用Das 2.0 程序处理20 名受试者的血药浓度-时间数据并进行计算。采用梯形法计算AUC0-t值和AUC0-∞值，以半对数作图法，由消除相的浓度点计算T1/2，Tmax和Cmax采用实测值，相对生物利用度(F)按公式:F =AUC0-t(受试制剂)/AUC0-t(参比制剂)×100%计算。AUC 和Cmax经对数转换后采用方差分析进行处理，并进一步采用(1 -2 α)置信区间和双单侧t 检验法评价制剂的生物等效性;Tmax采用非参数法检验(Wilcoxon 秩和检验)，对两种制剂作出生物等效性评价。

4 结果

4.1 血药浓度-时间曲线及药代动力学参数 血浆中氧去甲右美沙芬浓度，愈创木酚甘油醚浓度数据经Das 2.0 程序处理得到各主要药代动力学参数，试验药与对照药的平均药时曲线如图2 和图3;主要药代动力学参数见表3 和表4。

图2 氧去甲右美沙芬平均血药浓度-时间曲线

图3 愈创木酚甘油醚平均血药浓度-时间曲线

表3 氧去甲右美沙芬药代动力学参数(n=20，±s)

表3 氧去甲右美沙芬药代动力学参数(n=20，±s)

参数参比制剂试验制剂Tmax(h)2.08 ±0.441.65 ±0.33 Cmax(ng/ml)1 069.79 ±237.261 136.79 ±242.38 AUC0-t ng·h/ml5 601.46 ±873.045 893.07 ±938.43 AUC0-∞(ng·h/ml)5 723.04 ±848.066 029.60 ±893.16 T1/2(h)3.48 ±1.184.13 ±0.87

表4 愈创木酚甘油醚药代动力学参数(n=20，±s)

表4 愈创木酚甘油醚药代动力学参数(n=20，±s)

参数参比制剂试验制剂Tmax(h)0.71 ±0.120.61 ±0.13 Cmax(ng/ml)1 432.73 ±296.471 495.27 ±319.32 AUC0-t(ng·h/ml)2 056.16 ±424.272 091.43 ±413.87 AUC0-∞(ng·h/ml)2 102.87 ±424.352 144.17 ±417.22 T1/2(h)0.86 ±0.230.88 ±0.10

4.2 生物等效性 以愈美片为参比制剂，用面积法估算愈美干混悬剂的相对生物利用度、氧去甲右美沙芬为(105. 6 ± 9. 9)%、愈创木酚甘油醚为(102. 1 ±6.8)%，符合生物利用度要求。

将受试制剂愈美干混悬剂和参比制剂愈美片对氧去甲右美沙芬的血药浓度- 时间曲线下面积ln(AUC0-t)、ln(AUC0-∞)经方差分析无显著性差异;(1 - 2α)置信区间分别为101. 7% ～108. 7% 和102.1% ～108.7%，经双向单侧t 检验，受试制剂AUC的90%可信限在参比制剂的80% ～125%范围内，表明两种制剂在吸收程度上具有生物等效性;Tmax经非参数检验，两制剂间无显著性差异(P ＞0.05)。

两制剂的愈创木酚甘油醚AUC0-t、AUC0-∞经对数转换后进行方差分析无显著性差异;(1 -2α)置信区间分别为99.6% ～104.3%和99.5% ～104.7%，经双向单侧t 检验，受试制剂AUC 的90%可信限在参比制剂的80% ～125%范围内，表明两种制剂在吸收程度上具有生物等效性;Tmax经非参数检验，两制剂间无显著性差异(P ＞0.05)。

5 讨论

氢溴酸右美沙芬在体内代谢后，其活性代谢物(氧去甲右美沙芬)的含量可为原形物的20 ～100倍［2］，所以选择氧去甲右美沙芬作为本试验的待测物之一。

荧光检测器比紫外检测器具有检测灵敏度高、结果准确等特点，因此采用高效液相色谱-荧光检测器检测血浆中氧去甲右美沙芬和愈创木酚甘油醚浓度，方法较为理想。参照文献［3-5］中血药浓度测定的检测波长，选用280 nm 作为激发波长、313 nm 作为发射波长。

本文采用的提取溶剂选择性高，毒性低、沸点低、易于操作;参照文献［4，5］内标的选择，选用盐酸曲马多为内标进行色谱条件考查，灵敏度低，试验结果不理想;经试验后，最终确定选用提取特性与氧去甲右美沙芬和愈创木酚甘油醚相似的左氧氟沙星作为内标，消除了系统误差，同时灵敏度大大提高。

本试验受试验制剂为干混悬剂，参比制剂为普通片剂，氧去甲右美沙芬和愈创木酚甘油醚的代谢和吸收也受到剂型的影响，因二者剂型不同，干混悬剂较片剂吸收速度快，受试与参比制剂的氧去甲右美沙芬Tmax为(1.65 ±0.33)h 和(2.08 ±0.44)h ，愈创木酚甘油醚的Tmax为(0.61 ±0.13)h 和(0.71 ± 0.12)h，从统计结果来看其差异较为显著。

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5 葛庆华，周臻，支晓瑾，等. 血浆中去甲右美沙芬和愈创木酚甘油醚的HPLC 测定.中国医药工业杂志，2010，35(1):32