RP-HPLC 法测定硝酸毛果芸香碱滴眼液的有关物质*

吴 燕，米亚娴

(天津市药品检验所，天津 300070)

毛果芸香碱(pilocarpine)是由A 佩蒂特等于1879年从拉丁美洲产的毛果芸香叶中提取的一种生物碱，它属于拟胆碱药，主要作用于毒蕈碱样M 受体。硝酸毛果芸香碱滴眼液局部用于青光眼的治疗，在临床上应用广泛。该品种收载于《中国药典》2010 年版二部，标准中未制定有关物质检查项，经参考《英国药典》2010 年版［1］硝酸毛果芸香碱滴眼液的有关物质检查方法，建立了高效液相色谱主成分自身对照法，用于硝酸毛果芸香碱滴眼液中有关物质的测定，进一步完善了现行质量标准。

1 仪器与试药

岛津2010C 高效液相色谱仪，PDA 检测器。硝酸毛果芸香碱滴眼液(国内某企业);硝酸毛果芸香碱对照品(中国食品药品检定研究院提供，批号100157 -200201，纯度100%);磷酸二氢四丁基铵(进口试剂)、磷酸二氢铵、四丁基氢氧化铵均为分析纯，甲醇为色谱纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂，甲醇-含0.002 mol/L 磷酸二氢铵和0.001 8 mol/L 四丁基氢氧化铵的水溶液(30∶ 70)为流动相，变流速梯度洗脱(0 →20 min，0. 8 ml/min;20. 1 →39 min，1. 6 ml/min;39.1→44 min，0.8 ml/min)，检测波长为220 nm，进样量20 μl。

2.2 溶液制备

2.2.1 供试品溶液的制备 取本品，加水制成每1 ml中约含硝酸毛果芸香碱1.0 mg 的溶液，作为供试品溶液。

2.2.2 自身对照溶液制备 精密量取供试品溶液4 ml，置100 ml 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为自身对照溶液。

2.2.3 系统适用性溶液的制备 称取硝酸毛果芸香碱对照品约8.0 mg，溶于10 ml 0.002 5 mol/L 氢氧化钠溶液中，水浴加热30 min 后放冷，摇匀，作为系统适用性溶液，同时也作为毛果芸香酸定位溶液。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 按处方制备不含硝酸毛果芸香碱和抑菌剂的阴性样品，并按供试品溶液的制法制成阴性对照溶液。

2.3 系统适用性试验 取系统适用性溶液，进样20 μl，记录色谱图。结果表明，在该色谱条件下硝酸毛果芸香碱、异毛果芸香碱和毛果芸香酸的分离度均大于1.5，阴性对照在主成分和杂质相应的保留时间处无干扰。典型分离图见图1。

图1 供试品溶液(A)系统适用性溶液(B)阴性对照溶液(C)异毛果芸香碱定位溶液(D)HPLC 色谱图

2.4 线性考查 精密称定硝酸毛果芸香碱对照品适量，加水溶解并稀释制成系列浓度的溶液。分别精密量取上述溶液20 μl 注入液相色谱仪，记录色谱图;以浓度为横坐标，相对应的峰面积为纵坐标，进行线性回归。结果表明硝酸毛果芸香碱在0.510 ～153.1 μg/ml浓度范围内与其峰面积呈良好线性关系，回归方程为A=26 688 C-7 220.8(r=1.000 0)。

2.5 检出限试验 取硝酸毛果芸香碱对照品，用水稀释制成不同浓度的溶液，在选定色谱条件下，按信噪比为3 对最低检测量进行测定。结果表明，硝酸毛果芸香碱最低检出浓度0.2 μg/ml，检出限为4 ng。

2.6 溶液的稳定性 取供试品溶液分别于0、2、4、6和8 h 进样，考查溶液室温放置稳定性。结果表明，硝酸毛果芸香碱滴眼液有关物质检查供试液在8 h 内基本稳定。

2.7 有关物质测定 取本品2 批，分别按“2.2”项下的方法制备供试品溶液和自身对照溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，结果见表1。

表1 硝酸毛果芸香碱滴眼液有关物质测定结果

3 讨论

3.1 硝酸毛果芸香碱滴眼液收载于《中国药典》2010年版二部，未规定有关物质检查项;而英国药典2010年版硝酸毛果芸香碱滴眼液有关物质检查方法中HPLC 系统流动相使用的“磷酸二氢四丁基铵”试剂国内较难买到，且价格昂贵，试验中参考有关文献［2］，采用国产试剂“磷酸二氢铵”和“四丁基氢氧化铵”予以替代，经比较，两系统测定结果无明显差异，见表2。

表2 2#样品有关物质测定结果比较

3.2 滴眼液中通常加入抑菌剂来抑制细菌生长，从而防止眼用制剂在使用和保存过程中被泪液及环境中的微生物污染［3］。试验中发现，如仅采用等度洗脱方式将分析时间记录到主峰保留时间的2 倍(约20 min)，则在多次进样后会有异常峰出现。该峰经定性为抑菌剂峰，其在等度条件下(150 mm 短柱，0. 8 ml/min流速)出峰时间较长，故采用变流速梯度洗脱方法，既缩短了分析时间，又可将样品中的组分充分洗脱，同时可用于监测滴眼液中抑菌剂的含量变化。

3.3 硝酸毛果芸香碱滴眼液在临床上广泛用于青光眼的治疗，属于国家基本药物目录。有关物质检测方法的建立，完善了该产品的质量标准，有利于更好地监控产品质量，保障人民用药安全。

1 英国药典.2010:3008

2 肖仰，尚素琴.硝酸毛果芸香碱滴眼液的高效液相色谱分析及其稳定性考察.中国医院药学杂志，1999，19(2):91

3 安彦. 眼用制剂中抑菌剂的应用与质量控制. 天津药学，2011，23(1):56