维甲酸对转化生长因子β1诱导的HFL－I 细胞Ⅲ型胶原、STAT3 和PIAS3 表达的影响*

夏 武， 杨宇平， 陈永凤， 程 娜， 刘巨源△

(新乡医学院1药学院药理学教研室，2 第三附属医院呼吸内科，河南 新乡453003)

肺间质纤维化(pulmonary fibrosis，PF)是严重威 胁人类健康的疾病，迄今没有满意的治疗方法［1］。PF 过程中成纤维细胞(fibroblast，FB)大量增殖并转化为肌成纤维细胞(myofibroblast，MB)，MB 能分泌细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，ECM 占据肺泡腔并导致肺结构不可逆重构，造成呼吸衰竭［2］。Ⅲ型胶原(collagen Ⅲ)是ECM 成分之一，在PF 时表达显著增高。信号转导子和转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)可被多种细胞因子和生长因子激活，活化的STAT3 进入核内调控基因转录，调节机体多种生理和病理过程。活化STAT 蛋白抑制剂(protein inhibitor of activated STAT3，PIAS3)能特异性抑制STAT3 蛋白活性，阻断STAT3 与靶基因结合。STAT3 在纤维化疾病中的作用还不清楚，有研究发现STAT3 对肝脏、皮肤和肾脏的纤维化形成有调节作用。全反式维甲酸(all－trans－retinoic acid，ATRA)作用广泛多样，已有研究证实ATRA 具有抗纤维化作用，ATRA 能否通过影响STAT3 和PIAS3 的表达来改善PF 未见报道。因此本研究采用转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF－β1)诱导FB 向MB 转化制作肺纤维化体外细胞模型并给予ATRA 干预，应用RT－PCR 和Western blotting 方法观察ATRA 对TGF－β1诱导的HFL－I 细胞中collagen Ⅲ、STAT3和PIAS3 表达的影响，探讨ATRA 改善肺纤维化的机制。

材 料 和 方 法

1 试剂与仪器

人胚肺成纤维HFL－I 细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心;ATRA 购于Sigma，DMSO 溶解，现配现用;TGF－β1购于Peprotech，10 mmol·L－1HCl 溶解，现配现用;RT－PCR试剂盒购于宝生物(大连)有限公司;单克隆小鼠抗β－actin、STAT3 抗体和多克隆兔抗p－STAT3 抗体购于Santa Cruz;羊抗小鼠、羊抗兔－HRP 购自武汉博士德公司;PCR 扩增仪为ABI 产品;电泳仪、转膜仪为北京六一仪器厂产品;凝胶成像系统为上海领成生物科技有限公司产品;酶标仪为Thermo 产品。

2 方法

2.1 细胞培养与处理 HFL－I 细胞株采用含15%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、青霉素(100 kU·L－1)、链霉素(100 mg·L－1)的α－MEM 培养液，并于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养至对数生长期。所有实验均采用5 ～7 代细胞。5 μg·L－1TGF－β1刺激0 h、6 h、12 h、24 h、48 h 和72 h 后，RT－PCR法检测collagen Ⅲ、STAT3 和PIAS3 mRNA 表达，刺激0 d、1 d、3 d 和5 d 后，Western blotting 法检测STAT3 和pSTAT3 表达。维甲酸干预实验分为6 组:正常对照组;5 μg·L－1TGF－β1组;10 μmol·L－1ATRA 组;5 μg·L－1TGF－β1+ 0.1 μmol·L－1ATRA 组;5 μg·L－1TGF－β1+ 1 μmol·L－1ATRA组;5 μg·L－1TGF－β1+ 10 μmol·L－1ATRA 组。TGF－β1与ATRA 同时加入。24 h 后，RT－PCR 法检测各组细胞中collagen Ⅲ、STAT3 和PIAS3 mRNA表达;3 d 后，Western blotting 法检测STAT3 和pSTAT3 蛋白表达。

2.2 RT－PCR 检测collagen Ⅲ、STAT3 和PIAS3 mRNA 表达 Trizol 法提取细胞总RNA 并定量。取总RNA 2 μg 进行逆转录反应，各取2 μL 产物进行PCR反应扩增GAPDH、collagen Ⅲ、STAT3 和PIAS3。PCR扩增条件为:95 ℃5 min 预变性;95 ℃30 s，退火30 s，72 ℃1 min，30 个循环;72 ℃10 min。反应后各取2 μL PCR 产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，以目的片段与内参照GAPDH 比值进行半定量分析，每组实验重复3 次。引物序列、退火温度和产物大小见表1。

表1 PCR 引物序列、退火温度和产物大小Table 1. Primers and PCR reaction conditions

2.3 Western blotting 检测STAT3 和p－STAT3 蛋白表达 细胞总蛋白提取方法如下:加入细胞裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃12 000 r·min－1离心5 min，取上清。Bradford 法测定蛋白浓度。计算含20 μg总蛋白的溶液体积作为上样量，进行SDS－PAGE 电泳，转移至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h。STAT3 和p－STAT3Ⅰ抗室温孵育2 h 后4 ℃过夜，HRP 标记的Ⅱ抗室温孵育1 h 后，加显色液发光，显影定影。将胶片扫描后用Quantity One 图像分析软件进行各条带的灰度值测定。以目的条带与内参照β－actin 的比值作为半定量依据，每组实验重复3 次。

3 统计学处理

结 果

1 TGF－β1 和ATRA 对HFL－I 细胞collagen Ⅲ、STAT3 和PIAS3 mRNA 表达的影响

从图1 中可看出，与正常对照组相比，HFL－Ⅰ细胞经5 μg·L－1TGF－β1诱导后，collagen ⅢmRNA 12 h、24 h 和48 h 均明显上调(P ＜0.05)，24 h达到峰值;STAT3 mRNA 各时点均明显上调(P ＜0.05)，24 h 达到峰值;PIAS3 mRNA 12 h、24 h、48 h 和72 h 均明显下调(P ＜0.05)，48 h 达到峰谷，72 h 部分回升。从图2 中可知，与正常对照组相比，TGF－β1诱导HFL－I 细胞经24 h 后，collagen Ⅲ、PIAS3 和STAT3mRNA 表达均与图1 一致;经10 μmol·L－1ATRA 作用24 h 后，collagen Ⅲ、PIAS3 和STAT3 mRNA表达差异无统计学意义。与TGF－β1诱导组相比，不同浓度ATRA(0.1、1 和10 μmol·L－1)均可下调诱导细胞中collagen Ⅲ和STAT3 mRNA 的表达(P ＜0.05)，上调PIAS3 mRNA 的表达(P ＜0.05)。

2 TGF－β1 和ATRA 对HFL－Ⅰ细胞STAT3 和p－STAT3 蛋白表达的影响

如图3 所示，与正常对照组相比，HFL－Ⅰ细胞经5 μg·L－1TGF－β1诱导1 d、3 d 和5 d 后，STAT3和p－STAT3 蛋白表达明显上调(P ＜0.05)。由图4可知，与正常对照组相比，TGF－β1诱导HFL－Ⅰ细胞3 d 后，STAT3 和p－STAT3 蛋白表达明显上调(P＜0.05)，经10 μmol·L－1ATRA 作用3 d 后，STAT3蛋白表达差异无统计学意义，p－STAT3 蛋白表达稍有 上调(P ＜0.05)。与TGF－β1组相比，不同浓度ATRA(0.1、1 和10 μmol·L－1)均可下调TGF－β1诱导的STAT3 和p－STAT3 蛋白的表达(P ＜0.05)。

Figure 1. The expression of collagen Ⅲ，STAT3 and PIAS3 mRNA in TGF－β1－stimulated HFL－I cells detected by RT－PCR. ±s.n=3. * P ＜0.05 vs 0 h.图1 RT－PCR 检测TGF－β1 诱导的HFL－I 细胞collagen Ⅲ、STAT3 和PIAS3 mRNA 的表达

Figure 2. Relative expression of collagen Ⅲ，STAT3 and PIAS3 mRNA in the TGF－β1－stimulated HFL－I cells treated with ATRA. Lane 1:10 μmol·L －1 ATRA;Lane 2:TGF－β1 + 0.1 μmol·L －1 ATRA;Lane 3:TGF－β1 + 1 μmol·L －1 ATRA;Lane 4:TGF－β1 + 10 μmol·L －1 ATRA;Lane 5:TGF－β1;Lane 6:control. ±s.n =3. * P ＜0.05 vs control group;△P ＜0.05 vs TGF－β1 group.图2 RT－PCR 检测ATRA 对TGF－β1 诱导的HFL－I collagen Ⅲ、STAT3 和PIAS3 mRNA 表达的影响

讨 论

大多数PF 都有共同的病理过程，初期表现为肺泡炎，炎症和异常修复导致肺间质细胞增殖，产生大量的细胞外基质，导致肺组织的正常结构被囊性空腔所替代，使得肺泡气体－ 交换单元持久性丧失。PF 时肺结缔组织中存在大量纤维化灶，其中含大量MB，MB 是产生ECM 的主要细胞，也与ECM 沉积相关。PF 时还有大量细胞因子和生长因子活化，包括TGF－β1、表皮细胞生长因子(epidermal growth factor，EGF)、结缔组织生长因子(conneetive tissue growth factor，CTGF)、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)和白细胞介素－6(interleukin－6，IL－6)等，这些细胞因子和生长因子都具有促纤维化作用［3－4］。TGF－β1是至关重要的纤维化因子，TGF－β1可以诱导肺间质FB 发生表型转化变成MB。Vancheri 等［5］在体外实验证实了TGF－β1可诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化。

本实验组前期工作显示5 μg·L－1TGF－β1可以使HFL－I 细胞α－平滑肌肌动蛋白表达明显增加［6］，α－平滑肌肌动蛋白是MB 的标志性蛋白［7］，表明FB 部分向MB 转化，而且慢性纤维化疾病患者血清中的TGF－β1浓度接近5 μg·L－1［8］，所以本实验用5 μg·L－1TGF－β1诱导HFL－I 细胞向MB转化，制造体外PF 模型。

Figure 3. Relative expression of STAT3 and p－STAT3 proteins in TGF－β1－stimulated HFL－I cells detected by Western blotting.±s.n=3. * P ＜0.05 vs 0 d.图3 Western boltting 检测TGF－β1 诱导的HFL－I 细胞STAT3 和p－STAT3 蛋白的表达

Figure 4. Relative expression of STAT3 and p－STAT3 proteins in the TGF－β1－stimulated HFL－I cells treated with ATRA.Lane 1:control;Lane 2:TGF－β1;Lane 3:10 μmol·L －1 ATRA;Lane 4:TGF－β1 + 0.1 μmol·L －1 ATRA;Lane 5:TGF－β1 + 1 μmol·L －1 ATRA;Lane 6:TGF－β1 + 10 μmol·L －1 ATRA. ±s.n=3. * P ＜0.05 vs control group;△P ＜0.05 ATRA vs TGF－β1 group.图4 Western boltting 检测ATRA 对TGF－β1 诱导的HFL－I STAT3 和p－STAT3 蛋白表达的影响

在PF 时，MB 持续增殖，单个细胞的生存时间大大延长，包括collagen Ⅲ在内的ECM 成分含量显著增加［9］。有研究提示，collagen Ⅲ可作为判定间质纤维化早期或活动期的较好指标［10］。本实验研究表明TGF－β1诱导HFL－Ⅰ细胞12 h、24 h 和48 h 后collagen ⅢmRNA 表达较正常对照组相比均明显上调(P ＜0.05)。胶原表达增加可代替肺泡结构，使肺泡壁变形和破坏，加速PF 形成。

STAT3 可以被不同的细胞因子受体激活，细胞因子与受体结合后磷酸化STAT3 蛋白，磷酸化STAT3 蛋白形成同源或异源二聚体进入核内激活特异性基因表达。PIAS3 是STAT3 的特异性抑制子，PIAS3 可以通过与二聚化的STAT3 结合、掩盖STAT3 的DNA 结合区或与STAT3 单体结合阻碍其二聚化而阻断STAT3 的信号转导作用［11］。Pang等［12］研究发现STAT3 的抑制剂S3I－201 可以抑制肾纤维化时α－平滑肌肌动蛋白和纤连蛋白的表达。本研究表明TGF－β1诱导人胚肺成纤维细胞HFL－I 后，STAT3 mRNA 和蛋白表达明显升高，磷酸化STAT3 蛋白也显著增加，而PIAS3 mRNA 表达则明显下调，结果都使核内活性STAT3 增加。STAT3 靶基因的表达产物如Bcl－2、生存素、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等有促进细胞生存、拮抗细胞凋亡的作用，在PF 的病程发展中有重要作用［13］。活性STAT3 增加，使得Bcl－2、生存素、VEGF 等表达增加，加速PF病程。

ATRA 是维生素A 在生物体内的重要活性形式，其作用复杂多样，能促进免疫细胞增殖，影响骨的生长和上皮代谢，诱导肿瘤细胞分化等。机体内一定浓度的ATRA 可调节细胞的增殖、分化、成熟，是机体正常生长发育和各种生理活动必不可少的重要因子。在体内体外的实验中都发现ATRA 有抗肺纤维化活性。ATRA 可以抑制肺纤维化大鼠前胶原α1mRNA 表达和胶原蛋白合成［14］。Tabata 等［15］研究表明，ATRA 可以减轻辐射和博来霉素所致小鼠肺组织纤维化，降低TGF－β1、IL－6 和胶原蛋白的表达而起抗纤维化作用。本实验结果显示，ATRA 呈浓度依赖地降低TGF－β1诱导的HFL－I 细胞中collagen ⅢmRNA 表达(P ＜0.05)，使胶原的合成减少而起抗纤维化作用。进一步研究发现，各浓度的ATRA都降低TGF－β1诱导的HFL－I 细胞中STAT3 mRNA 和蛋白表达及磷酸化STAT3 水平，上调PIAS3 mRNA 表达。这表明ATRA 抗纤维化作用与STAT3和PIAS3 有关，ATRA 可通过抑制STAT3 和p－STAT3 使肺纤维化相关基因活化减少来改善PF，具体调控过程与调控基因有待进一步研究。

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