原子力显微镜观察青蒿琥酯对人胃癌细胞株SGC－7901 膜表面形貌的影响*

柳佳利， 王 珣， 杨亚萍， 梁志红， 孙 浩， 林 熙， 张 洋

(暨南大学1医学院临床医学专业，2分析测试中心，3医学院医学药理学系，广东 广州510632;4广东省人民医院病理医学部检验科，广东 广州510080)

细胞膜是由磷脂双分子层和镶嵌、贯穿在其中及吸附在其表面的蛋白质组成。它不单是细胞的物理屏障，而且在细胞的生命活动中还发挥着细胞间信号的检测与传递、物质运输、能量转换、细胞表面识别和细胞分化等许多复杂的功能。由于细胞外部化学信号无论是作用于细胞核的信号，还是作用于核外的信号，它们的传递都必须经由细胞膜，与细胞膜表面的受体结合，或经膜表面的特殊部位，如膜通道，进入到细胞内发挥作用。因此研究细胞膜的形态和功能对认识膜分子的信号转导，蛋白质分选及膜微结构域的生理功能有重要的意义。

原子力显微镜(atomic force microscope，AFM)自20 世纪80 年代问世以来，已经广泛应用于生物医学领域［1］。AFM 通过探测探针与被测样品之间微弱的相互作用力(范德华力)来获取样品表面形貌的信息，与传统的光学显微镜和电镜相比，AFM 具有制作标本简单、观察环境广泛、高分辨率的2D 和3D 形貌图像［2］，以及在分子水平上进行力谱曲线的检测，获得细胞机械性能的相关物理参数［3］等诸多优点。AFM 被广泛应用于红细胞、淋巴细胞、细菌等成像研究［4-6］，使AFM 成为观察和鉴别某些细胞的有力工具;同时近些年来，AFM 亦用于肿瘤细胞的成像研究，可作为检测肿瘤细胞的凋亡以及评估抗肿瘤药物疗效的工具［7］。青蒿琥酯(artesunate，ART)是中药青蒿提取物青蒿素的衍生物，已证实青蒿素及其衍生物具有抗疟疾、抗肿瘤、免疫调节等多种重要药理作用，其中抗肿瘤作用日益受到重视［8］。如Yamachika 等［9］提出青蒿素通过诱导细胞的凋亡而杀伤肿瘤细胞;Cai 等［7，10］应用AFM 观察了青蒿素诱导Jurkat 细胞株(急性T 细胞白血病细胞系)凋亡，促使Jurkat 细胞膜的损伤的作用。尽管目前国内外对青蒿素抗肿瘤的作用有不少的报道，但利用AFM 观察青蒿素对肿瘤细胞膜(尤其是对实体瘤的细胞膜)形貌影响的相关报道仍比较少。本文以人胃癌细胞株SGC -7901 为研究对象，通过作用不同浓度的ART，采用原子力显微镜来观察药物对细胞表面形貌和超微结构的影响，并结合流式细胞术和激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡的情况。

材 料 和 方 法

1 主要试剂和仪器

人胃癌细胞株SGC -7901(中山大学中山医学院);青蒿琥酯注射用灭菌粉末(广西桂林制药厂);RPM I -1640 培养基及胰酶(Gibco);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司);Annexin V -FITC 试剂盒(南京凯基生物技术发展有限公司);DAPI 荧光探针(Sigma)。倒置显微镜(Olympus);BIOSCOPE Catalyst Scanasyst 型原子力显微镜(Bruker);FACS Aria 型流式细胞仪(BD);LSM 510 型激光共聚焦显微镜(Karl Zeiss)。

2 方法

2.1 细胞培养 将人胃癌细胞株SGC -7901 接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基中，置5%CO2、37 ℃的孵箱中常规培养，细胞贴壁生长，每2 ～3 d 换液1 次，当细胞生长汇合时，按1∶3 传代，每周传代1 ～2 次。用0.25%胰蛋白酶+0.02% 乙二胺四乙酸消化，收集对数生长期细胞进行实验。

2.2 AFM 样品制备 取对数生长期细胞，用完全培养液调整细胞浓度为1 ×109cells/L，接种于6 孔培养板中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h 后加入不同浓度(2.5 μmol/L、5 μmol/L 和10 μmol/L)青蒿琥酯。药物作用24 h后用PBS 洗涤并重悬，滴于玻片上，使其自然铺展，吸附10 min。然后用pH 7.4的PBS 缓冲液冲洗，用1%戊二醛溶液固定15 min，用蒸馏水冲洗3 次，室温自然干燥后上机观察。

2.3 AFM 样品成像 将制备好的样品置于Nano-Scope AFM 载物台上，利用Olympus 倒置显微镜观察细胞的分散情况，在大气中应用AFM 对样品进行扫描成像。在操作软件中选择 Scanasyst 模式，Scanasyst-Air 型探针，微悬臂弹性系数为0.4 N/m。AFM 图像经过自带软件(Nanoscope Analysis)平滑处理，以消除扫描方向上的低频背景噪音。通过测量细胞核高度反映经药物作用后细胞核是否发生坍塌、肿胀等变化，利用软件测量纳米级表面粗糙度来观察膜表面的粗糙程度，反映细胞表面超微结构的变化。

2.4 流式细胞术检测各组细胞凋亡情况 采用Annexin V - FITC 和PI 双染法对凋亡细胞进行检测。具体操作如下:收集对数生长期的SGC -7901细胞，常规消化后，接种于6 孔板，每孔加细胞液1 mL，待24 h 细胞完全贴壁后，加入青蒿琥酯干预24 h，然后用胰酶消化，在Buffer 液体中重悬，调整细胞浓度为1 ×109cells/L，加FITC 结合的Annexin V和PI 孵育15 min，上流式细胞仪测定凋亡细胞所占比例。流式细胞仪激发光波长采用488 nm，检测光波长采用525 ～550 nm 的绿色FITC 荧光和 ＞575 nm 的红色PI 荧光。活细胞仅有很低的荧光强度，早期凋亡细胞有较强的绿色荧光，晚期凋亡细胞有绿色和红色荧光双重染色。每样本收集1 ×105个细胞荧光信号，Cellquest 软件分析结果，细胞凋亡率(%)=(早期凋亡细胞数+晚期凋亡细胞数)÷ 细胞总数×100%。

2.5 DAPI 染色检测细胞凋亡 取对数生长期细胞，用完全培养液调整细胞浓度为1 ×109cells/L，接种于6 孔培养板中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h 后，加入青蒿琥酯干预24 h，然后用PBS 洗涤并重悬，加入浓度为1 μmol·L-1DAPI 荧光染料，室温避光反应15 min，于激光共聚焦显微镜观察并拍摄图像。激发光为405 nm 氩离子激光，检测波长BP 420 ～470 nm。物镜为63 倍油镜，针孔直径为1 μm。扫描激光强度为8%，观察细胞核形态，以细胞皱缩、核固缩、染色质凝聚和荧光强度增强等作为凋亡细胞指征。

3 统计学处理

采用SPSS 11.5 统计分析软件处理。数据以均数±标准差(±s)表示，组间均数比较采用单因素方差分析，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 青蒿琥酯对SGC－7901 细胞形态学的影响

倒置显微镜下观察各组细胞，对照组细胞贴壁生长牢固，呈长梭形或三角形，分化较好，细胞明亮清晰，折光性好，胞质分布均匀，且在细胞中间部分有明显的细胞核，见图1A。不同浓度的青蒿琥酯作用24 h 后，细胞贴壁不牢，细胞脱落，悬浮细胞增多，细胞变圆，体积变小，伴核固缩，染色质浓缩致密，胞质内分泌颗粒增多，细胞折光性下降，可见大量细胞碎片，见图1B、C、D。

2 原子力显微镜观察药物作用后细胞表面形貌的变化

应用原子力显微镜在大气中对4 组细胞扫描成像，获得了各组单个细胞的拓扑形貌图和三维结构图，并对细胞表面超微结构进行扫描分析。结果发现，与对照组相比，3 组加药组的细胞形态明显不同。扫面范围为40 μm×40 μm，对照组的细胞铺展的舒展，核区饱满，膜表面平坦光滑，见图2A、E;而3 组加药组细胞逐渐萎缩，核区发生明显塌陷，核区高度依次降低，见图2M、N、O、P，且膜表面形成了明显的孔洞，凹陷和裂隙。随药物浓度的加大，孔洞直径加大，数量增多，见图2B、C、D、F、G、H。利用原子力显微镜自带的分析软件Nanoscope Analysis 测量核区高度:对照组(1280.41 ±82.52)nm 显著高于2.5 μmol/L ART 组(855.38 ±76.88)nm，5 μmol/L ART组(742.82 ±39.82)nm 和10 μmol/L ART 组(648.25 ±34.01)nm，P ＜0.05，见表1。这说明药物使肿瘤细胞的膜表面形貌和细胞核形态均产生了变化。

Figure 1. Morphological changes of SGC - 7901 cells treated with different concentrations of ART for 24 h (×200).A:control;B:2.5 μmol/L ART;C:5 μmol/L ART;D:10 μmol/L ART.图1 不同浓度的青蒿琥酯处理SGC－7901 细胞24 h 后细胞形态的变化

为了进一步探索细胞膜结构与药物之间的关系，用AFM 获取细胞表面精细结构发现，AFM 能清楚地观察到细胞表面布满颗粒状物质，且颗粒形态有明显差异。对照组表面颗粒较密集，有的呈条索状，有的聚集成团，堆积较为紧凑，见图2I。而加药组细胞表面有明显的陷窝，颗粒稀少，分布较疏松，见图2J、K、L。细胞表面粗糙度是与细胞形貌相关的重要参数之一，通过分析软件测量得到超微结构参数值，见表1。与对照组细胞膜表面的平均粗糙度(average roughness，Ra)和均方粗糙度(root mean square roughness，Rq)(Rq = 89.96 nm ±8.90 nm，Ra= 74.20 nm ±8.05 nm)相比，随药物浓度的增加，2.5 μmol/L ART 组(Rq = 59.28 nm ± 7.65 nm，Ra = 46.98 nm ±6.54 nm)，5 μmol/L ART 组(Rq = 53.28 nm±6.98 nm，Ra = 42.28 nm± 6.77 nm)和10 μmol/L ART 组(Rq = 49.36 nm ±6.81 nm，Ra=38.86 nm± 5.38 nm)均降低(P ＜0.05)。目前认为AFM 观察到得这些膜表面颗粒是细胞表面蛋白质、脂、糖等生物大分子的超微表征，它们在细胞生命活动中发挥着重要作用。粗糙度是细胞形貌的超微结构重要参数之一，已证实细胞表面粗糙度的大小与细胞骨架的完整性相关［11］。我们推测粗糙度的降低可能是药物作用于膜表面分子，使细胞骨架发生重排，导致细胞呈现不同的形貌，而这些形貌的改变被认为是与细胞粘附、增殖等特性密切相关的［12-13］。由AFM 获得的以上这些定量的数据是无法由其它高分辨率成像仪器(例如透射电子显微镜、扫描电子显微镜和激光共聚焦扫描显微镜)获得的。

Figure 2. AFM morphological images of SGC-7901 cells treated with different concentrations of ART for 24 h. A，E，I，M:control;B，F，J，N:2.5 μmol/L ART;C，G，K，O:5 μmol/L ART;D，H，L，P:10 μmol/L ART. A ～D:topography (40 μm×40 μm);E ～H:three-dimensional morphological images;I ～L:ultrastructure of the corresponding areas in A ～D;M ～P:height profiles along the corresponding lines in A ～D.图2 不同浓度的青蒿琥酯处理24 h 后各组细胞的原子力显微镜形貌图

表1 不同浓度的青蒿琥酯作用下SGC－7901 细胞的各种超微结构参数Table 1. Ultrastructure parameters of SGC -7901 cells treated with different concentrations of ART(nm. ±s.n=6)

表1 不同浓度的青蒿琥酯作用下SGC－7901 细胞的各种超微结构参数Table 1. Ultrastructure parameters of SGC -7901 cells treated with different concentrations of ART(nm. ±s.n=6)

* P ＜0.05 vs control.

Group Mean height Surface root mean square roughness Surface average roughness Control 1280.41±82.52 89.96±8.90 74.20±8.05 2.5 μmol/L ART 855.38±76.88* 59.28±7.65* 46.98±6.54*5 μmol/L ART 742.82±39.82* 53.28±6.98* 42.28±6.77*10 μmol/L ART 648.25±34.01* 49.36±6.81* 38.86±5.38*

3 流式细胞术检测细胞凋亡

经流式细胞术分析，2.5、5 和10 μmol/L ART 作用于SGC -7901 细胞24 h 后，细胞凋亡率分别为(9. 80 ±0. 99)%、(17. 70 ±1. 87)% 和(21. 20 ±2.28)%，细胞凋亡率逐渐增加，与对照组［(6.90 ±0.69)%］相比，均有显著差异(P ＜0.05)，见表2。

表2 各组凋亡率比较Table 2. Comparison of the apototic rate in each group (%. ±s.n=6)

表2 各组凋亡率比较Table 2. Comparison of the apototic rate in each group (%. ±s.n=6)

* P ＜0.05 vs control.

Group Apotosis rate Control 6.90 ±0.69 2.5 μmol/L ART 9.80 ±0.99*5 μmol/L ART 17.70 ±1.87*10 μmol/L ART 21.20 ±2.28*

4 DAPI 荧光染料染色观察细胞核形态

激光共聚焦显微镜显示，对照组细胞形态规则，偶有凋亡细胞，见图3A。ART 作用24 h 后，加药组呈现出许多凋亡细胞的形态:细胞皱缩，核呈波纹状，折缝样或菊花状，部分染色质出现浓缩状态，见图3B;细胞核的染色质高度凝聚、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状，见图3C;细胞凋亡晚期细膜依然完整，核裂解为碎块，形成膜包被的细胞碎片产生凋亡小体，见图3D。

Figure 3. The apoptosis of SGC -7901 cells treated with different concentrations of ART observed under laser scanning confocal microscope (DAPI staining).A:control;B:2.5 μmol/L ART;C:5 μmol/L ART;D:10 μmol/L ART.图3 激光扫描共聚焦显微镜观察不同浓度青蒿琥酯诱导的SGC－7901 细胞的凋亡情况

讨 论

本研究利用AFM 高分辨的成像特点，选取人胃癌细胞株SGC-7901 为研究对象，通过作用不同浓度的抗肿瘤药物青蒿琥酯，观察药物对肿瘤细胞表面形貌的影响。AFM 结果显示:加药组细胞核发生萎缩和塌陷，核区高度明显下降，我们推测细胞出现了凋亡形态学的改变，结合流式细胞仪检测到的青蒿琥酯诱导细胞凋亡，激光共聚焦显微镜在形态学上进一步证明了细胞发生了凋亡，形成了凋亡的典型形态-凋亡小体。提示AFM 图像的细胞核区的变化可能正是细胞形态随凋亡的发展而发生的相应改变，凋亡过程中伴随一系列的形态学变化，当药物浓度较低时，细胞核出现凋亡的早期变化，即细胞脱离临近细胞，胞质及胞浆浓缩，染色质固缩，AMF 图像观察到细胞萎缩，核高度降低;随药物浓度的加大，出现凋亡核碎裂、核微块等，细胞核完全崩解，所以AMF 图像观察到细胞核萎缩，坍塌，核区高度进一步的降低。由此可见，细胞凋亡的发生、发展与AFM 图像的核区变化呈对应关系。我们还观察到细胞膜表面形成了明显的孔洞和凹陷;随药物浓度的增加，空洞变大，数量也增多。这是细胞膜完整性受到破坏的表现，必将改变细胞内外的离子环境，影响正常的生化过程，提示药物可能有改变膜通透性的作用。因为药物促进肿瘤细胞凋亡的途径可能是多方面的。通过超微结构观察到加药组细胞颗粒状物质的形态有明显差异，膜表面粗糙度降低。细胞表面粗糙度是与细胞形貌相关的重要参数之一，已证实细胞表面粗糙度的大小与细胞骨架的完整性相关。细胞骨架是真核细胞中的蛋白质纤维网络系统，构成细胞的骨骼，支持着整个细胞，它紧贴在细胞膜下，赋予细胞一定的形状，对细胞及细胞器的运动也起着至关重要的作用。细胞骨架包括3 种类型，即微丝、中间纤维及微管。微丝的主要构成成分是肌动蛋白(actin)，在细胞内以两种形式存在:聚合态(fibrous actin，F-actin)和游离态(globular actin，G-actin)，F-actin 呈纤维状，参与维持细胞的形态、赋予质膜机械强度，细胞的运动，胞质分裂，肌肉收缩等多种功能，其结构重排及聚合和解聚的变化，在一定程度上反映了细胞的功能状况。F -actin 能够解聚成G -actin，G -actin 也能够聚合成F -actin，这个过程是可逆的。正常情况下细胞内的两种肌动蛋白处于动态平衡状态，当受到一定的刺激后，细胞内游离的G-actin 彼此结合形成F-actin，进而通过自身螺旋组装形成微丝，此过程即细胞的骨架重排。微丝的重组装与分布，为细胞内外信息传递提供分子桥梁，控制细胞形态、运动、增殖等生物效应。细胞骨架的改变是细胞凋亡的一个重要标志［14］。药物诱导肿瘤细胞发生凋亡的途径可能是多方面的，其中有可能是通过细胞骨架来实现的。而另一方面，细胞凋亡的发生、发展也需要依赖细胞骨架结构和功能的完整性，细胞凋亡过程中伴随的一系列形态学改变，如凋亡细胞从周围细胞中脱离、胞质出芽、凋亡小体的形成等也都是与细胞骨架系统密不可分［15-16］。

Ehrenhoefer 等［17］提出AFM 观测到的细胞膜表面的这些颗粒很可能是膜表面的蛋白质、脂、糖等的单体或聚集体等特化结构。在细胞的生命活动中，膜磷脂双分子层内富含鞘脂类和胆固醇的细胞膜微结构域，可选择性地募集某些蛋白分子，此微结构域像“筏”一样，在细胞膜表面可侧向移动，故而被称为脂筏(lipid raft)。脂筏区含有很多的脂质及蛋白质组分，在细胞膜转运和细胞信号转导过程中发挥着重要作用，当参与信号转导和蛋白质运转时，其构像也会发生相应的转化和优化，有利于蛋白质之间的相互作用。van Meer 等［18］在诱导凋亡的药物实验中发现，脂伐参与配体、受体和激酶之间相互作用所激发的细胞信号转导而激活凋亡途径。因此我们推测青蒿琥酯与脂伐内凋亡有关的信号分子结合，使蛋白质发生变构，启动细胞内信号转导的级联反应而诱导靶细胞凋亡，具体机制有待进一步研究。

本研究利用原子力显微镜在纳米级分辨率下观察到抗肿瘤药物对肿瘤细胞膜超微结构的影响，为研究抗肿瘤药物与细胞膜的相互作用提供新的思路，使原子力显微镜发展成为研究生命科学的一个有力工具，为揭示药物的作用机制提供可视化参考。如果将AFM 和其它仪器设备(如透射电子显微镜、扫描电子显微镜、激光共聚焦扫描显微镜、生物质谱、核磁共振等)有机地结合起来，相互补充，取长补短，一定会获得很好的研究结果。

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