携带中国株HIV－1 gp120 基因的重组腺病毒的构建及其感染巨噬细胞的形态学研究*

王 通， 马文心， 郭嘉慧， 陈智鹏， 崔毅峙

(暨南大学生命与健康工程研究院，广东 广州510632)

我国HIV－1 的流行株主要为B、B'、C 及AE 亚型，其中中国株HIV－1 病毒主要指我国B 亚型流行株，针对其开展病毒学和病理生理学研究有现实意义［1］。

目前研究发现，HIV－1 感染者的癌症发生风险显著提高，从而形成了HIV－1 研究领域的一个备受关注的领域，即HIV－1 相关恶性肿瘤(HIV－1－associated malignancies，HAM)问题。HAM 研究主要以队列研究为主，目的是确证各种癌症与HIV－1 感染的相关性，而罕见针对HAM 发生机制的研究。

已知HIV－1 可在骨髓中感染造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)，以整合(原病毒)和未整合(胞浆HIV－1 DNA)形式建立潜伏感染，持续慢性复制和释放子代病毒［2－3］。原病毒在高效抗逆转录病毒治疗(highly active anti－retroviral therapy，HAART)下不会被根除，仍可在外周血单核细胞中持续，成为组织HIV－1 的来源［4］。例如，在HIV 脑传播机制中，有“木马假说”认为，携HIV DNA 的单核细胞可能跨血脑屏障，在大脑中建立HIV 感染［5］。而未整合HIV－1 DNA 也可能通过类似的木马机制被单核细胞传播至组织。这些携有HIV DNA 的单核细胞将会分化为含HIV DNA 的巨噬细胞，并进而启动组织炎症产生应答，从而提供多种刺激细胞增殖的细胞因子，包括IL－6、TNF－α 和IL－1［6］。

这些促增殖细胞因子可能是诱发HAM 的一个主要因素，HIV－1 gp120 蛋白就是这些因子在巨噬细胞内上调的病毒来源激动蛋白之一。因此，本研究首先构建可表达HIV－1 Gp120 蛋白的重组腺病毒，并将HIV－1 gp120 DNA 导入小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow－derived macrophages，BMM)，并研究这种含HIV－1 gp120 DNA 的BMM(BMM－gp120)的形态学表型变化特征。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 主要材料 人胚肾转化细胞293Ad5+细胞系购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC);6 ～8 周龄BALB/c 小鼠购自暨南大学实验动物中心;流式细胞仪FACS Aria 购自BD。腺病毒纯化试剂盒购自Biomiga;Millipore 0.22 μm 滤膜购自Syringe;14 kD 透析膜购自联合碳化物公司。

1.2 主要试剂 pDC316－mCMV－EGFP 和pBHGlox－E1，3Cre 质粒由深圳市百恩维生物科技有限公司提供;中国株HIV－1CNgp120 基因由哈尔滨医科大学王福祥教授惠赠［7］。LipofectamineTMLTX、PLUSTMReagents、PE 结合的抗鼠CD11b 单克隆抗体、DMEM 培养基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、双抗和ACK Lysing Buffer 均购自Invitrogen。HIV－1 gp120 ELISA 检测试剂盒购自上海丰翔生物科技有限公司。M－CSF(macrophage colony－stimulating factor)购自R＆D。极低贴壁6 孔细胞培养板购自Corning。核酸内切酶Nhe I 与Hind III 购自TaKaRa。

2 方法

2.1 重组腺病毒穿梭质粒的构建 本部分由深圳百恩维公司协助完成，以质粒pEGFP－N1－gp120为模板，经PCR 扩增gp120 基因，并克隆至pDC316－mCMV－EGFP 质粒，获得pDC316－mCMV－EGFP－gp120 穿梭质粒。用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒，并分别用Nhe I 与Hind III 进行酶切鉴定。

2.2 重组腺病毒的包装与扩增 将293Ad5+细胞以5 ×105cells /well 接种于6 孔板中。用含10%FBS 的DMEM 培养基(无抗生素)，并置37 ℃、5%CO2的温度湿度培养箱中培养24 h。每孔加pBHGlox－E1，3Cre 质粒4 μL、pDC316－mCMV－EGFP或pDC316－mCMV－EGFP－gp120 穿梭质粒1 μL，以及Lipofectamine 10 μL。继续培养24 h，在倒置荧光显微镜下观察发绿荧光细胞比例，确定转染效率。继而每24 h 观察1 次并记录细胞形态变化。待板孔内细胞长满后，将所有细胞及培养基转入T25 培养瓶继续培养，再度长满后续转T75 瓶。总计约10 d后，可见细胞出现葡萄状聚团即细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)，此时轻柔吹落细胞并收集，再用1 mL PBS 重悬细胞，并将细胞反复置于－80 ℃及37 ℃冻融3 次。离心收取冻融液，为第1 代病毒。将293Ad5+细胞接种于T75 瓶中，待其长至80% 汇合度(confluence)，加入500 μL 第1 代病毒，并用含抗生素、5% FBS 的DMEM 培养基继续培养细胞，直至细胞出现CPE 现象时，收集培养基及细胞冻溶液以获得第2 代病毒。

2.3 重组腺病毒的纯化 该方法的原理是以病毒特异性亲和柱捕获重组腺病毒，进而洗脱病毒达到纯化目的。具体操作为取15 mL 离心管，弃盖，将病毒纯化柱装入，300 ×g 离心2 min。掰断纯化柱下盖，让原浸柱液流出。后加入2 mL 超纯水，及5 mL 1 × wash buffer。将含第2 代病毒的培养基和细胞冻融液以0.22 μm 滤膜过滤除杂后上样。待样品液过柱后，加入2 ～3 mL 1 × elution buffer，将被柱吸附的病毒洗脱。收集洗脱液装入14 kD 孔径透析袋，以D－PBS 为透析液，4 ℃过夜透析病毒样品。透析最长时间≤18 h。待样品脱色至透明后，收集样品。再次以0.22 μm 滤膜过滤除杂。得到工作病毒，以－80 ℃冻存。

2.4 重组腺病毒ELISA 鉴定 设标准曲线梯度为1 ×10－7mg/L、5 ×10－8mg/L、2.5 ×10－8mg/L 和0 mg/L，以DMEM 培养基及PBS 为对照。样品稀释5倍加入，每个样品做3 个复孔，分别为Ad－HIV－1 gp120 感染细胞的培养基上清(Ad－gp120 supernatant)和细胞裂解液(Ad－gp120 cell lysate);Ad－GFP 感染细胞的培养基上清(Ad－GFP supernatant)和细胞裂解液(Ad－GFP cell lysate)。加样后封板4 ℃过夜，洗板，每孔加入酶标试剂(结合辣根过氧化物酶的抗gp120 抗体)50 μL，37 ℃温育30 min。再次洗板，加显色液避光15 min。终止显色后以450 nm 波长测吸光度值。

2.5 重组腺病毒TCID50滴度测定 将生长状况良好的293Ad5+细胞以每孔1 ×104接种于96 孔板中，每孔培养体积为100 μL，培养24 h 后，每孔分别加入100 μL 不同稀释度的重组病毒液(包括:10－4、10－5、10－6、10－7、10－8、10－9、10－10和10－11)。培养3 d 后，荧光显微镜下进行荧光计数。按照Karber 公式［8］，病毒滴度为T =10L－d(s－0.5)，L =log10(最高稀释度)，d = log10(稀释度差值)= 1，s = 阳性比率之和，计算病毒效价。

2.6 重组腺病毒滴度感染复数(multiplicity of infection，MOI)复验 择6 ～8 周龄小鼠，颈椎脱臼法处死后酒精消毒，生物安全柜内解剖，取其完整股骨及胫骨，除净肌肉，去骨两端，用DMEM 冲出骨髓，250 ×g离心5 min 收集沉淀，以适当比例ACK 裂解红细胞杂质，过70 μm 滤膜收集骨髓单细胞悬液。将细胞按1×106cells/well，接种于极低贴壁6 孔板内。加入含10 μg/L M－CSF 及10% FBS 的DMEM 分化培养基培养6 d，得到分化成熟的BMM。向每孔BMM 细胞分别加入不同浓度的P1 代Ad－GFP 及Ad－gp120病毒各100 μL(设置MOI 梯度为0.1、1 和10)。48 h 后，将各孔细胞分别收集入EP 管，PBS 洗1 次，以100 μL PBS 重悬细胞，按每1 ×106cells /well 对应0.3 μL CD11b－PE 之比例加入CD11b－PE 抗体混匀，避光静置30 min 后用流式细胞仪检测，CD11b 阳性细胞为BMM，GFP 阳性细胞为感染细胞。细胞形态学改变用荧光显微镜观察。

3 统计学处理

流式细胞术结果利用FlowJo 7. 6. 5 软件分析(TreeStar)。统计数据利用GraphPad Prism 5.0.2 软件分析。多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用Student's t 检验，数据以均数±标准差(±s)表示，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 成功获得重组腺病毒质粒

用Nhe I 与Hind III 对pDC316－mCMV－EGFP－gp120 质粒做酶切鉴定后在电泳凝胶的约4.5 kb位置出现DNA 条带，分子量与gp120 基因相符。经测序表明，穿梭质粒所携带gp120 确为中国株HIVCN基因［7］。

2 成功构建重组腺病毒

由于AdMax 系统所用骨架质粒为缺陷病毒基因组，故此病毒仅能借助特殊细胞系293Ad5+的细胞基因组Ad5+区互补完善自身，并跟随细胞复制而自行复制。感染后培养48 h，光镜观察可见贴壁细胞出现漂浮、团聚，并呈葡萄状等典型的CPE 现象，见图1A、B;其荧光视野可见GFP 荧光。根据AdMax系统工作原理，当细胞可表达GFP 时可证明穿梭质粒和骨架质粒已经通过Cre/LoxP 重组整合，表明腺病毒胞内组装成功，即携中国株HIV－1 gp120 基因的重组腺病毒(Ad－gp120)及其对照空载病毒(Ad－GFP)构建成功，见图1。为了最大程度上减少变异，本研究所有感染实验所用重组腺病毒均为1 ～3代病毒。

Figure 1. The cytopathic effects of recombinant adenoviruses on infected 293Ad5 + cells.Scale bar = 20 μm.图1 重组腺病毒感染293Ad5 +细胞的细胞病变效应观察

3 HIV－1 gp120 蛋白表达

由于AdMax 系统的目的基因和GFP 为分别表达，因此，我们采用ELISA 技术对HIV－1 gp120 蛋白表达进行确证性研究。作为阴性对照，培养基和PBS 对照的吸光度值平均值，以及样品标准曲线的Y轴节距均在0.31 左右，因此我们将本ELISA 检测低限(lower limit of detection，LLD)设置在0.31，见图2。该LLD 高于对照组(Ad－GFP)感染的细胞裂解液和上清以及Ad－gp120 感染的细胞培养上清的吸光度值。据此，仅有Ad－gp120 细胞裂解所得上清(Ad－gp120 cell lysate)的吸光度值显著高于其它各组，见图2，其为gp120 蛋白阳性，且蛋白浓度均值为4.1 ×10－8mg/L。这表明Ad－gp120 在293Ad5+细胞内表达了gp120 蛋白。

4 重组腺病毒滴度测试及MOI 复验

按照Karber 法计算，Ad－gp120 病毒滴度为108.3TCID50/mL;Ad－GFP 病毒滴度为108.1TCID50/mL。以此滴度为依据设定MOI 梯度感染BMM，流式结果符合TCID50法计算所得结果，见图3。巨噬细胞本身不含GFP，故可依据绿荧光的比率判断病毒的感染效率。在MOI = 0.1 时，33.2%的细胞为GFP阳性，而当MOI = 1 和10 的时候，该比率上升到84.7%和84.9%。在MOI 相差10 倍时荧光比率没有更大变化，可证明MOI=1 时已基本达到最大感染率，见图3。其中，BMM 的纯度由CD11b+细胞所占比率反映，从图3 可见，各组CD11+BMM 所占比率均高于93%。

5 Ad－gp120 感染的巨噬细胞的表型改变

Figure 2. Expression of HIV－1 gp120 in 293Ad5 + cells.LLD:lower limit of detection，which is 0.31. ±s. n =3.＊＊P ＜0.01 vs other groups.图2 gp120 蛋白在293Ad5 +细胞中的表达

Figure 3. Capacity of Ad－gp120 of infecting BMM at different MOI (from left to right:control，MOI=0.1，MOI=1，MOI=10).图3 流式细胞术检测不同MOI 梯度的Ad－gp120 感染BMM 的能力

在MOI 等于1 时，不同重组腺病毒感染BMM 出现了显著的形态差别，见图4。BMM 在Ad－GFP 感染下，呈贴壁生长，并主要为梭形和圆形，见图4A、B。而在Ad－gp120 感染后，表现为包括拉长、伪足形成、分枝和不规则形变等，见图4C、D。尤其是，Ad－gp120 感染的BMM 的细胞形状指数(shape index=细胞长度/细胞平均宽度)显著高于Ad－GFP 细胞［P ＜0. 05，n = 10，即从高倍视野(high power fields，HPF)中随机选取10 个细胞］，见图4E。这表明，Ad－gp120 感染可介导BMM 形态改变。

讨 论

HIV－1 gp120 由env 基因所编码，是HIV 的包膜蛋白，为HIV 主要毒性因子之一，可特异性识别和结合CD4 和CCR5/CXCR4 等细胞表面受体，介导病毒与细胞膜融合进入细胞;或可桥联含HIV 细胞与正常细胞的融合以介导病毒感染正常细胞［9］。gp120 可通过内源和外源途径促进单核巨噬细胞分泌巨噬细胞炎症蛋白1α(macrophage inflammatory protein 1α，MIP－1α)、MIP－1β、受激活调节正常T细胞表达和分泌因子(regulated upon activation，normal T cell expressed and secreted，RANTES)、IL－1β、TNF－α、IL－10 等细胞因子，同时还包括全部3 种丝裂原激活蛋白激酶，即ERK、p38 和JNK［6］。这些炎症应答产物均与肿瘤细胞的增殖、迁移和分化等有密切关系。

HIV DNA 在巨噬细胞内不整合即降解［10］。但目前研究发现，未整合的HIV DNA 在巨噬细胞中至少可持续30 d，期间HIV－1 env(包括gp120 和gp41)、nef 和tat 等病毒基因持续转录，而rev 和vif几乎不转录，体现了潜伏感染的特征［11］。本研究所提供的BMM－gp120 细胞正是HAM 周围含HIV－1 DNA 巨噬细胞的理想模型，从而有利于进一步开展HAM 的机制研究。

腺病毒的滴定方法通常为紫外分光光度法测VP 值，但此法不能排除包装缺陷病毒或无感染能力病毒颗粒［12－13］。故本实验采用并改进了可检活病毒感染力的TCID50滴度测试法［14］。传统TCID50测定需通过观察细胞CPE 有无判断阳性与否，故一般需10 d 左右知道结果。而本实验中的病毒可表达GFP，故我们观察到有绿荧光孔基本可判断为阳性孔。本研究表明，滴毒后24 h 可见绿荧光，滴毒3 d后则可确定阳性孔数量，且由于此时阳性孔内荧光点数基本 ＞3 处，假阳性孔也可以被区分。

Figure 4. Morphological changes of recombinant adenovirus－infected BMM. ±s.n=10. * P ＜0.05 vs Ad－GFP.图4 重组腺病毒感染BMM 的形态学改变

近年来，流式细胞术因其检测快捷，结果直观等优点，在检测病毒感染方面得到了广泛运用，但也有诸多论文指出其误差率较大［15］。故本实验同时采用传统TCID50滴度测试和流式细胞术检测MOI 法，相互印证以保证病毒滴度结果的可信度。

AdMax 系统构建重组腺病毒有较多优点，包括同源重组效率较高、从质粒构建到重组出毒时间短，且在293Ad5+中，其转染成功率大于98%。另外，有报道指出该系统出毒后，95%的病毒子含目的基因，故非常有利于目的基因的功能研究［16］。

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