DNMT 在胃癌中的表达及DNMT 抑制剂5－氮杂－2'－脱氧胞苷对胃癌的影响

何 苗， 汤为学， 姜 蓉， 范 晶， 张 能， 查 朗， 王子卫△

(重庆医科大学1附属第一医院普通外科，2附属第一医院实验研究中心，3基础医学院，4附属第一医院急诊科，重庆400016)

DNA 甲基化转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)是催化DNA 甲基化修饰的生物酶。一般认为DNMT 高表达导致抑癌基因高甲基化并失活是肿瘤发展的表观遗传机制［1］。但也有资料表明DNMT 低表达及癌基因低甲基化并激活亦是肿瘤的重要特点［2－4］;加上既往对DNMT 的研究集中在DNMT1、DNMT3A 和DNMT3B，而对DNMT2 和DNMT3L 探索甚少。本文遂全面分析5 种DNMT 在胃癌与胃黏膜的表达特点，以期对胃癌(肿瘤)表观遗传学的研究提供参考。

材 料 和 方 法

1 材料

胃癌与对应癌旁组织(60 对)由重庆医科大学附属第一医院胃肠外科提供，标本病理诊断明确。SGC－7901、MKN－45(胃癌细胞株)及GES－1(胃黏膜上皮细胞株)由重庆医科大学附属第一医院实验研究中心馈赠。DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B 和DNMT3L 抗体购自Santa Cruz;免疫组化与免疫荧光相关试剂购自中杉金桥;免疫印迹相关材料购自碧云天;噻唑蓝(MTT)和5－氮杂－2'－脱氧胞苷(5－aza－2'－deoxycytidine)购自Sigma。其它基本实验材料购自鼎国昌盛与惠尔利公司。

2 方法

2.1 免疫组织化学 免疫组化法参照中杉金桥公司提供的试剂盒说明书进行。Ⅰ抗孵育采用4 ℃过夜(Ⅰ抗稀释比为1∶50);显色时间均为5 min。

2.2 免疫组化结果判断 根据细胞着色程度区分染色(a):0(无染色)，1(浅黄色)，2(黄褐色)，3(褐红色)。区分染色细胞占相应细胞总体的比率(b):1(b ＜25%)，2(25% ≤b ＜50%)，3(50% ≤b ＜75%)，4(b≥75%)。再根据a × b 判断阳性结果(c):阴性(c=0)，弱阳性(c =1、2)，阳性(c =3、4、6、8)，强阳性(c =9、12)。计算表达率包括弱阳性、阳性和强阳性的资料。

2.3 细胞培养 SGC－7901、MKN－45 和GES－1细胞均用加10%胎牛血清的RPMI－1640 培养基培养;常规置于37 ℃、5%CO2孵箱内。3 d 传代或更换培养基1 次。

2.4 免疫荧光 接种细胞株至96 孔板，孵育24 h。将孔板内细胞按固定(4%多聚甲醛，室温20 min)、打孔(0.5%Triton X－100，37 ℃20 min)、封闭(山羊血清封闭液，37 ℃30 min)、Ⅰ抗孵育(1∶50，4 ℃过夜)、荧光Ⅱ抗孵育(1∶50，37 ℃1 h)的顺序处理。设立PBS 代替Ⅰ抗的阴性对照。荧光显微镜观察结果。

2.5 Western 免疫印迹 收集细胞，免疫印迹法按参考文献［5］记录的方法进行，实验重复3 次，Quantity One 软件分析结果。

2.6 噻唑蓝比色法 细胞于对数生长期接种至96孔板，1 ×104cells/well，250 μL 培养基/well。5－氮杂－2'－脱氧胞苷终浓度5 μmol/L、50 μmol/L 和500 μmol/L 处理上述细胞。于1、2、3、4、5 d 加MTT(5 g/L，20 μL/well)，4 h 后弃培养基加二甲亚砜(150 μL/well)，酶标仪490 nm 波长测A 值。设立阴性对照(不加药)及空白对照(无细胞)组，实验设复孔5 个。细胞增殖率= (A目的－ A空白)/(A对照－A空白)。

2.7 流式细胞仪检测 细胞平均接种至2 个培养瓶，培养24 h。5－氮杂－2'－脱氧胞苷终浓度50 μmol/L处理其中之一，继续培养96 h。收集2 瓶细胞，PBS 洗涤2 次，分别加入1 mL 70%乙醇中4 ℃固定过夜。第2 d 送流式细胞仪检测细胞周期与凋亡率。实验重复3 次。

3 统计学处理

采用SPSS 17.0 统计软件处理。计数资料用卡方检验、Fisher 精确概率检验或符号秩检验分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示，用单因素方差分析比较均数。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 DNMT 在人胎盘组织表达

根据部分DNMT 抗体说明，取胎盘组织为DNMT 阳性对照标本。5 种DNMT 均在人胎盘组织表达，以DNMT2 显著，见图1，提示抗体与免疫组化步骤无误。

Figure 1. Expression of DNMT2 in human placenta tissue(×400).图1 DNMT2 在人胎盘组织的表达

2 胃癌与癌旁组织中DNMT 的表达

Figure 2. Expression of DNMT in gastric cancer and corresponding non－cancerous tissues(×400).图2 DNMT 在人胃癌及癌旁组织的表达

免疫组化法检测胃癌及癌旁组织DNMT 表达的结果见图2、3。癌旁组织DNMT1 表达率63. 3%(38/60)，DNMT2 表达率93.3%(56/60)，DNMT3A表达率71.7%(43/60)，DNMT3B表达率93.3%(56/60)，DNMT3L 表达率75.0%(45/60)。胃癌组织DNMT1 表达率11. 7% (7/60)，DNMT2 表达率43.3%(26/60)，DNMT3A 表达率15.0%(9/60)，DNMT3B 表达率85.0%(51/60)，DNMT3L表达率36.7%(22/60)。可见除DNMT3B 外，其余DNMT 在胃癌的表达率不如癌旁组织(P ＜0. 05)。此外，DNMT1 和DNMT3L 为胞核胞浆共表达，DNMT2 为胞核表达，而DNMT3A 和DNMT3B 为胞浆表达。

3 DNMT 在胃癌与癌旁组织的配对比较

胃癌与自身癌旁组织配对，60 对组织的DNMT表达差异见图4。其中癌旁组织表达低于胃癌组织记为“－”(如癌旁为阳性，癌为强阳性);癌旁组织表达高于胃癌组织记为“+”(如癌旁为阳性，癌为弱阳性);两者表达无差异记为“0”(如两者均为阳性)。运用符号秩检验分析5 种DNMT 在胃癌及癌旁组织的差异，发现DNMT1 和DNMT3A 在胃癌表达显著低于癌旁组织(P ＜0.01);DNMT2 和DNMT3L 在胃癌表达低于癌旁组织(P ＜0.05);DNMT3B 在胃癌及癌旁中表达无显著差异(P ＞0.05)。与结果2 相符合。

4 DNMT 与胃癌临床特征的关联

卡方检验及Fisher 精确概率检验分析DNMT 与胃癌临床特征的关联，结果见表1。DNMT2 表达与胃癌分化及临床分期相关(P ＜0.05);DNMT3A 表达与胃癌临床分期相关(P ＜0.05)。而其余DNMT 与性别、年龄、肿瘤大小、幽门螺旋杆菌感染等临床特征无显著关联(P≥0.05)。

5 胃癌与胃上皮细胞株中DNMT 的定位

免疫荧光法研究DNMT 在胃癌与胃上皮细胞中的定位发现，DNMT2 在胞核表达显著，见图5A;DNMT3B 和DNMT3L 在胞浆表达，见图5B;而DNMT1与DNMT3A 特异绿色荧光甚弱。

6 胃癌与胃上皮细胞株中DNMT 的差异

免疫印记法研究DNMT 在胃癌与胃上皮细胞中表达差异，结果见图6、7。DNMT3B 在GES－1 细胞中表达较MKN－45 和SGC－7901 细胞增强(P ＜0.05);DNMT2 和DNMT3L 在各细胞表达无显著差异(P ＞0.05);而DNMT1 和DNMT3A 在各细胞几无表达。

Figure 3. The positive expression of DNMT in 60 pairs of gastric cancer and corresponding non－cancerous tissues. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs non－cancerous tissue.图3 DNMT 在60 对人胃癌及癌旁组织的阳性表达

Figure 4. Differential expression of DNMT between gastric cancer and corresponding non－cancerous tissues.－:expression of DNMT in non－cancerous tissue was lower than that in gastric cancer tissue. +:expression of DNMT in non－cancerous tissue was higher than that in gastric cancer tissue. 0:expression of DNMT in non－cancerous tissue was similar to that in cancer tissue. DNMT1 and DNMT3A expression in cancer tissues was lower than that in non－cancerous tissues (＊＊P ＜0.01，sign rank test). DNMT2 and DNMT3L expression in cancer tissues was lower than that in non－cancerous tissues (* P ＜0.05，sign rank test). The differential expression of DNMT3B between cancer and non－cancer was not significant .图4 胃癌及配对癌旁组织的DNMT 差异

表1 不同胃癌临床特征中DNMT 的表达差异Table 1. Differential expression of DNMT in different clinicopathologic features of gastric cancer［n(%)］

Figure 5. Fluorescence microscopy image of DNMT expression in cell lines(×100). A:DNMT2 was located in nucleus(SGC－7901);B:DNMT3B was located in cytoplasm(MKN－45).图5 DNMT 表达定位

Figure 6. Protein expression of some DNMT in cell lines detected by Western blotting.图6 部分DNMT 蛋白在胃癌细胞与胃黏膜上皮细胞表达

7 5－氮杂－2'－脱氧胞苷对胃癌与胃上皮细胞增殖的影响

噻唑蓝比色法分析5－氮杂－2'－脱氧胞苷不同浓度及作用时间对SGC－7901、MKN－45 和GES－1 细胞增殖的影响，结果见图8。5－氮杂－2'－脱氧胞苷对各细胞株增殖率无显著影响(P ＞0.05)。

8 5－氮杂－2'－脱氧胞苷对胃癌细胞与胃黏膜上皮细胞周期分布与凋亡的影响

流式细胞术分析5－氮杂－2'－脱氧胞苷对胃癌细胞与胃黏膜上皮细胞周期分布和凋亡率的影响，结果见图9、10。5－氮杂－2'－脱氧胞苷对各细胞株周期分布与凋亡无显著影响(P ＞0.05)。

讨 论

DNA 甲基化是表观遗传学在肿瘤领域的研究热点［6］。异常DNA 甲基化可致肿瘤基因转录异常，并被看作肿瘤发展表观遗传机制之一［7］。因肿瘤具有整体基因组低甲基化及抑癌基因高甲基化的特点［8］，且DNMT 是催化DNA 甲基化修饰的生物酶，故普遍认为DNMT 在肿瘤中异常表达［9］。DNMT 可分DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B 和DNMT3L 5 种［10－11］。

一般理论是，各种DNMT 在肿瘤高表达，通过高甲基化抑癌基因并抑制其转录而促进肿瘤发展［12－13］。但肿瘤基因组也有整体甲基化率降低的特点［14］。例如正常细胞基因组CpG 岛甲基化率高达80%，而癌细胞中则降低20%至60%［15］，此现象不能被DNMT 高表达所解释。且不少研究证实癌基因低甲基化并激活亦是肿瘤重要表观遗传特点［4，14，16］，这让我们疑惑“抑癌基因高甲基化失活”与“癌基因低甲基化激活”谁在肿瘤中起主导作用?加上新近资料［3］发现DNMT3A 在肿瘤中表达降低，并与肿瘤增殖、侵袭和转移负相关(起抑癌基因作用)!又让我们深思DNMT 低表达与癌基因低甲基化并激活的联系，及此联系与肿瘤的关系。总之，已有不少资料向肿瘤中DNMT 绝对高表达的理论提出挑战。

Figure 7. Differential expression of some DNMT in different cell lines. DNMT3B expression was higher in GES－1 cells than in MKN－45 and SGC－7901 cells. ±s.n=3. ＊＊P ＜0.05 vs SGC－7901 and MKN－45.图7 DNMT 在胃癌与胃上皮细胞的表达差异

Figure 8. The growth rates of different cell lines with 5－aza－2'－deoxycytidine treatment (MTT assay). A:SGC－7901 cells;B:MKN－45 cells;C:GES－1 cells. ±s.n=5.图8 细胞株经5－氮杂－2'－脱氧胞苷处理后的增殖率

Figure 9. The cell cycle distribution of cell lines with 5－aza－2'－ deoxycytidine treatment(flow cytometry analysis).C:control;T:treated with 5－aza－2'－deoxycytidine.±s.n=3.图9 细胞株经5－氮杂－2'－脱氧胞苷处理后的周期分布

Figure 10. The apoptotic rates of cell lines with 5－aza－2'－deoxycytidine treatment(flow cytometry analysis). ±s.n=3.图10 细胞株经5－氮杂－2'－脱氧胞苷处理后的凋亡率

本研究结果提示，“DNMT 高表达导致抑癌基因高甲基化并失活”可能并非胃癌发展的关键机制，至少胃癌中抑癌基因的高甲基化并非由DNMT 高表达所致。此外，抑制DNMT 可能对胃癌与胃上皮细胞增殖、周期分布、凋亡的影响也十分有限。至少在短期内(5 d)，抑制DNMT 不对胃癌增殖、凋亡起决定性作用。故本文不支持肿瘤DNMT 绝对高表达并促癌发展的观点。那么胃癌是否存在DNMT 低表达与癌基因低甲基化并激活的联系?以及此联系是否与胃癌发展相关?还有构建DNMT 过表达载体转染胃癌细胞是否对其增殖、凋亡有影响?目前尚不能确定，亟待进一步实验证实。

肿瘤表观遗传研究属新兴科研领域，未知性与不确定性强;近年此领域虽已获不少进展，但可用于肿瘤临床诊治的仍稀少，故需更多学者前赴后继的探索与付出。

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