盐霉素抑制耐格列卫的人慢性粒细胞白血病细胞株K562/Glv 增殖并诱导其凋亡*

徐霜清， 祝爱珍， 刘成成， 许婷婷， 陈小宇， 刘革修△

(1 中南大学湘雅医学院检验系，湖南 长沙410013;2 广州金域医学检验中心，广东 广州510330;3暨南大学医学院血液病研究所，广东 广州510632)

尽管酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼可抑制BCRABL 激酶活性，对慢性期慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)治疗有效，但很难达分子学缓解。越来越多的研究表明，白血病复发和耐药的根本原因是白血病干细胞(leukemia stem cells，LSC)的存在［1］。因此，寻找新的、清除LSC 的药物以减少耐药与复发十分必要。最近的研究发现一种名为盐霉素(salinomycin)的抗生素可以直接杀死肿瘤干细胞，其杀死小鼠身上乳腺癌干细胞的效力比普通抗癌药物泰克索(taxol)高100 倍［2－3］。本实验观察盐霉素对耐格列卫的白血病细胞株K562/Glv 细胞增殖的影响，并对其作用机制进行了初步研究，为盐霉素应用于慢性粒细胞白血病治疗探索新的思路。

材 料 和 方 法

1 主要试剂

盐霉素、台盼蓝、Triton X－100、DMSO 和PI 染料购自Sigma。RPMI－1640 培养液和胎牛血清购自Gibco。细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)、caspase－3、caspase－8、caspase－9 和JC－1线粒体膜电位(ΔΨm)检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。细胞色素C 凋亡检测试剂盒购自Bio-Vision。Fluo－3AM 购自Biotium。Epics XL 型流式细胞仪购自Beckman Coulter。Annexin V－PI 双染测定细胞凋亡试剂盒购自Invitrogen。

2 细胞和细胞培养

格列卫耐药慢粒细胞株K562/Glv 由天津中国医学科学院血液病研究所惠赠。细胞用含10% 胎牛血清、1 ×105U/L 青霉素及100 mg/L 链霉素的RPMI－1640 培养液，置于含5% CO2、饱和湿度、37 ℃孵箱中培养，2 ～3 d 传代。

3 盐霉素对细胞生长的抑制作用

检测盐霉素对K562/Glv 细胞的剂量－效应关系，取对数生长期细胞，调整密度为2 ×108cells/L，100 μL/well，盐霉素设有0.1、0.2、0.4、0.8 和1.6 μmol/L 浓度梯度，设5 个复孔，同时设DMSO 对照孔和不加细胞的调零孔，5%CO2、饱和湿度、37 ℃孵育48 h，加入CCK－8 试剂孵育3 h 后在全自动酶标仪上检测各孔的吸光度(A)值(测量波长490nm)。根据实验数据计算得半数抑制浓度(half inhibitory concentration，IC50)=0.37 μmol/L。绘制0.2 μmol/L 盐霉素对K562/Glv 细胞的时间－效应曲线，孵育时间:0、24、48、72、96 h，测量方法同上。

4 Annexin V－PI 双染测定细胞凋亡

取对数生长的K562/Glv 细胞，2 ×105cells/well接种至12 孔板内，以0.2 μmol/L 盐霉素处理，对照组加入1% DMSO，作用48 h 后，消化收集细胞，PBS洗涤，弃上清，加入200 μL 试剂盒提供的结合缓冲液，重悬细胞后，分别加入10 μL Annexin V－FITC和5 μL PI，轻轻混匀，4 ℃避光反应30 min，再加入300 μL 结合缓冲液，上机检测。

5 ΔΨm、ROS 和细胞内Ca2+浓度(［Ca2+］i)的检测

取对数生长期的K562/Glv 细胞，以2 ×105cells/well 接种至12 孔板，加入0.2 μmol/L 盐霉素处理，在6 h、12 h、24 h 时收集细胞，PBS 洗涤2 遍。500 μL JC－1(10 mg/L)重悬细胞检测ΔΨm，500 μL DCFH－DA (5 μmol/L)重悬细胞检测细胞产生的ROS，10 μmol/L 荧光染料Fluo－3AM 检测［Ca2+］i浓度，37 ℃避光孵育20 min，PBS 洗3 次，即刻用流式细胞仪检测，激发波长为488 nm，发射波长为530 nm。

6 检测caspase－3、caspase－8 和caspase－9 活性

取对数生长期的K562/Glv 细胞，以2 ×105cells/well 的密度接种至12 孔板，加入盐霉素0.2 μmol/L，分别处理0、12、24 h，按照试剂盒说明收集细胞，预冷PBS 洗涤后重悬于细胞裂解液中，冰上裂解30 min，4 ℃下10 000 ×g 离心10 min，取上清加入显色底物(caspase－3 底物Ac－DEVD－pNA、caspase－8底物Ac－IETD－pNA 和caspase－9 底物Ac－LEHD－pNA)，终浓度50 μL/L，均匀混合并加入到96 孔板中，每组5 个复孔，避光孵育4 h，在405 nm 处检测A 值。

7 Western blotting 检测细胞色素C、Bcl－2、Bax、β－catenin 和磷酸化低密度脂蛋白受体相关蛋白6(phosphorylated low－density lipoprotein receptor－related protein 6，p－LRP6)的表达

取对数生长期的K562/Glv 细胞，分别以0.2、0.4、0.8、1.6 μmol/L 盐霉素处理48 h，收集细胞PBS 洗2 遍，加入蛋白抽提液抽提总蛋白。取蛋白50 μg，经10% SDS－PAGE 电泳分离，常规转移至PVDF 膜，5% 脱脂奶粉37 ℃封闭2 h，鼠抗人细胞色素C、Bcl－2、Bax、β－catenin 抗体(Santa Cruz)、p－LRP6(Ser1490)抗体(Cell Signaling Technology)或β－actin 抗体(Chemicon International)4 ℃孵育过夜，1∶5 000 稀释的HRP 标记的Ⅱ抗室温孵育1 h，化学发光法观察蛋白的表达。目的条带用Image－Pro Plus 分析软件进行灰度值分析，以β－actin 内参照校正。

8 统计学处理

结 果

1 盐霉素对K562/Glv 细胞增殖的抑制作用和诱导凋亡作用

结果显示，0.1 ～1.6 μmol/L 盐霉素对K562/Glv 细胞生长呈剂量依赖性抑制作用，0.1、0.2、0.4、0.8 和1.6 μmol/L 盐霉素细胞增殖抑制率分别为(89.56 ± 2.30)%、(28.70 ± 2.31)%、(53.77 ±3.02)%、(75.98 ±3.30)%和(89.56 ±3.43)%，与对照组比较差异显著(P ＜0.05)，见图1A。计算得IC50=0.37 μmol/L。0.2 μmol/L 盐霉素处理K562/Glv 细胞24 h 时即显示明显细胞增殖抑制作用，抑制率为(14.78 ±2.24)%，随着时间延长抑制作用越来越明显，72 h 细胞抑制率为(43.86 ±2.31)%，96h为(55.34 ±3.42)%，见图1B。流式细胞术检测结果显示0.2 μmol/L 盐霉素能够诱导K562/Glv 细胞凋亡，出现明显亚G1二倍体峰，且随着时间的增加，作用越明显，48 h 细胞凋亡率为(15.66 ±2.23)%，对照组及DMSO 组凋亡率分别为(5.63 ±1.47)%和(5.70 ±1.48)%，见图2。

2 盐霉素对K562/Glv 细胞ΔΨm、ROS 和［Ca2+］i的影响

结果显示，0.2 μmol/L 盐霉素作用K562/Glv细胞，ΔΨm在6 h 时即显著下降，24 h 时下降至最低，为对照组的(47.5 ±2.3)%;细胞内ROS 在6 h时已显著升高，24 h 时仍然高于对照组水平(144.7±4.5)%;［Ca2+］i在6 h 时已显著升高，为对照组的(163.6 ± 5.6)%，24 h 时下降至接近对照组水平。

Figure 1. Inhibitory effect of salinomycin on Gleevec－resistant chronic myeloid leukemia cell line K562/Glv.A:dose－effect relationship (48 h);B:time－effect relationship (0.2 μmol/L). ± s. n =5. * P ＜0.05 vs control (0 μmol/L or 0 h).图1 盐霉素对K562/Glv 细胞的生长抑制作用

Figure 2. Salinomycin induced apoptosis of K562/Glv cells.图2 盐霉素诱导K562/Glv 细胞凋亡

Figure 3. Effects of salinomycin on mitochondria membrane potential (ΔΨm)，reactive oxygen species(ROS)and intracellular Ca2+ concentration (［Ca2+］i)in K562/Glv cells. ± s. n =5. ＊＊P ＜0.01 vs control(0 h).图3 盐霉素对K562/Glv 细胞线粒体膜电位、活性氧和细胞内Ca2+的影响

3 盐霉素对K562/Glv 细胞caspase－3、caspase－8和caspase－9 活性的影响

结果显示，0.2 μmol/L 盐霉素作用K562/Glv 细胞后，caspase－8 和caspase－9 活性在6 h 时已经达到较高水平，而且之后仍然维持在这高水平;caspase－3 活性则随着时间而增加，呈时间－效应关系，与对照组比较，差异有统计学意义(P ＜0.01)。这表明盐霉素通过先激活caspase－8 和caspase－9，再激活caspase－3，从而诱导细胞凋亡，见图4。

Figure 4. Effects of salinomycin on activity of caspase－3，caspase－8 or caspase－9 in K562/Glv cells. ±s. n=5. ＊＊P ＜0.01 vs control (0 h).图4 盐霉素对K562/Glv 细胞caspase－3、caspase－8 或caspase－9 活性的影响

4 盐霉素对K562/Glv 细胞Bcl－2、Bax、细胞色素C、β－catenin 和p－LRP6 蛋白的影响

结果显示，0.2 μmol/L 盐霉素作用K562/Glv 细胞48 h，Bcl－2 表达出现下调、Bax 表达则明显增加，Bcl－2/Bax 比值显著降低，同时胞浆细胞色素C显著增加，β－catenin 和p－LRP6 蛋白水平也显著下降，见图5。结果说明盐霉素不仅通过Bcl－2/Bax和细胞色素C 途径诱导细胞凋亡，而且通过K562/Glv 细胞抑制细胞增殖。

Figure 5. Effects of salinomycin on the levels of cytochrome C，Bcl－ 2，Bax，β－catenin and p－LRP6 in K562/Glv cells. 1:control;2:salinomycin. ±s.n =5. ＊＊P ＜0.01 vs control.图5 盐霉素对K562/Glv 细胞Bcl－2、Bax、细胞色素C、β－catenin和p－LRP6 蛋白的影响

讨 论

BCR－ABL 靶点特异药物格列卫是目前CML 治疗的一线药物，但是也不乏有临床格列卫耐药的现象。残留的LSC 及原始祖细胞，成为该疾病复发的主要因素［1，4－5］。所以，寻求新的治疗方案以清除肿瘤干细胞、减少耐药与复发仍然十分必要。

LSC 由Lapidot 等［6］在急性髓系白血病的研究中首先提出，具有与正常造血干细胞相同的特征，即自我更新、无限繁殖以及多向分化潜能。许多研究表明，Wnt/β－cfatenin 信号途径在LSCs 中具有重要作用，解释了传统化疗不能根除白血病的原因［1，7］。所以，寻找抑制该信号途径并诱导细胞凋亡药物进行研究具有意义。

最近研究显示，盐霉素通过Wnt 信号途径抑制慢性淋巴细胞白血病细胞增殖并诱导其凋亡［7］。盐霉素属于聚醚类一元羧酸，由白色链霉菌发酵产生，具有特殊的环状结构，是典型的离子载体抗生素，它对细胞中的阳离子，尤其K+、Na+、Rb+的亲和力特别强，使生物所必需的阳离子通过膜上脂质屏障的浸透性增强，妨碍细胞内外阳离子的传递，使细胞内外离子浓度发生变化，从而影响渗透压，最终使细胞崩解，起到杀菌作用。

本研究结果显示，盐霉素不仅通过降低β－catenin 和p－LRP6 蛋白水平抑制耐格列卫的K562/Glv细胞生长，而且通过使ΔΨm下降、细胞色素C 和Ca2+的释放，增加细胞内ROS，以及激活caspase－3、－8 和－9，降低Bcl－2/Bax 比值，诱导细胞凋亡。我们推测其作用本质可能与［Ca2+］i变化有关。Bcl－2 家族、线粒体细胞色素C 及caspase 是细胞内凋亡信号通路的基本成分，而［Ca2+］i变化对它们的活性状态调节具有重要影响［9］。该实验结果为改善慢性髓系白血病临床治疗方法提供新的依据。但如何应用盐霉素于该疾病的临床治疗还有待进一步研究。

［1］ Chen Y，Peng C，Sullivan C，et al. Critical molecular pathways in cancer stem cells of chronic myeloid leukemia［J］. Leukemia，2010，24(9):1545－1554.

［2］ Gupta PB，Onder TT，Jiang G，et al. Identification of selective inhibitors of cancer stem cells by high－throughput screening［J］. Cell，2009，138(4):645－659.

［3］ 曾 葭，刘成成，祝爱珍，等. 盐霉素抑制人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP 增殖及诱导凋亡的机制［J］.中国病理生理杂志，2012，28(5):834－838.

［4］ White DL，Saunders VA，Dang P，et al. OCT－1－mediated influx is a key determinant of the intracellular uptake of imatinib but not nilotinib (AMN107):reduced OCT－1 activity is the cause of low in vitro sensitivity to imatinib［J］. Blood，2006，108(2):697－704.

［5］ Corbin AS，Agarwal A，Loriaux M，et al. Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR－ABL activity［J］. J Clin Invest，2011，121(1):396－409.

［6］ Lapidot T，Sirard C，Vormor J，et al.A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice［J］.Nature，1994，367(6464):645－648.

［7］ Wang Y，Krivtsov AV，Sinha AU，et al. The Wnt/β－catenin pathway is required for the development of leukemia stem cells in AML［J］. Science，2010，327(5973):1650－1653.

［8］ Lu D，Choi MY，Yu J，et al. Salinomycin inhibits Wnt signaling and selectively induces apoptosis in chronic lymphocytic leukemia cells［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108(32):13253－13257.

［9］ Lalier L，Cartron PF，Juin P，et al. Bax activation and mitochondrial insertion during apoptosis［J］. Apoptosis，2008，12(5):887－896.