二苯乙烯苷对LPC 损伤血管内皮细胞的保护作用及其机制*

2012-12-23张燕堂王家富商战平

中国病理生理杂志 2012年7期

张燕堂，张颖，郑文，杨华，王家富，商战平△

(泰山医学院1校医院，2放射学院，4免疫学教研室，5病理生理学教研室，山东泰安271016;3山东省交通医院检验科，山东济南250031)

心脑血管疾病是危害人类健康最常见的病症之一，特别是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)疾病所导致的并发症和死亡率迅速增多，目前已成为全球人口死亡的首位原因，对人体造成的危害越来越引起人们的重视。研究表明［1］，伴随以一氧化氮(nitric oxide，NO)生物利用度降低为主而导致内皮损伤被认为是引起AS 的始动环节。有研究表明非对称性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)与L -精氨酸竞争性抑制NO 的合成，在调节NO 合成中具有重要作用，它通过影响NO 合成而导致血管内皮功能障碍［2］，研究发现传统中药何首乌中最主要有效的活性成分二苯乙烯苷(2，3，5，4'-tetrahydroxysilbene -2-O-β-D-glucoside，TSG)具有明显的促进血管内皮细胞增殖的作用［3］，本研究旨在探讨TSG 对损伤的血管内皮细胞的保护作用及其机制。

材料和方法

1 主要试剂及仪器

人脐静脉血管内皮细胞株、细胞凋亡试剂盒均购自南京凯基生物科技发展有限公司;胰蛋白酶和溶血磷脂酞胆碱(lysophosphatidylcholine，LPC)均购自Sigma;DMEM 液体培养基和胎牛血清购自Gibco;ADMA试剂盒购自ID;MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(cell proliferation and cytotoxicity assay kit)、NO 试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;人血管性血友病因子(vWF)ELISA 检测试剂盒购自北京奇松生物科技有限公司，二苯乙烯苷由中国人民解放军泰安第88 医院药剂科馈赠;其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。FACSCalibur 流式细胞仪(BD);Infinite F200 多功能酶标仪(TECAN)。

2 细胞的培养及其生物学特征

细胞经培养、传代并经人von Willebrand 因子鉴定其含量为100.02 ±2.94，将第3、4 代用于实验。镜下观察，细胞由均匀状态变为紧密贴壁生长，呈铺路石状，并可见多种细胞形态，以多角或长条形多见，胰酶消化折光性好、变圆、变亮。内皮细胞贴壁生长、生长的密度依赖性及接触抑制等生物学特征。细胞经LPC损伤后可见其排列紊乱，胞体收缩变圆，细胞间隙增大，胞膜边缘不清，部分细胞悬浮脱落。经TSG 处理后状况有所好转，形态接近正常，细胞间隙缩小，连接增加，边界变清，见图1。

Figure 1. Cell damage and processing(×200).A:control;B:LPC;C:LPC+TSG.图1 镜下细胞损伤与处理

3 主要方法

3.1 实验分组 10 mg/L LPC 作用于人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，孵育24 h 诱导内皮细胞损伤，建立细胞损伤的模型(LPC 组);10.0、1.0 和0.1 μmol/L TSG 预先作用于HUVECs 1 h 后，再给予10 mg/L LPC 作用于HUVECs 共同孵育24 h，建立TSG+LPC 组;同时，设立不加药物的空白对照组。然后，收集细胞及上清液测定指标。以上每组随机设不低于3 个复孔，在不同时间实验重复3 次。

3.2 MTT 比色法测定细胞的存活率按照试剂盒说明书的要求操作，吸弃培养基，加入新培养基，排除药物对MTT 的影响，每孔加入20 μL MTT 溶液(5 g/L)，继续培养4 h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150 μL 二甲基亚砜(DMSO)，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm 处测量各孔的吸光值(A)。细胞存活率(%)=(测定管A 值-空白管A 值)/(标准管A 值-空白管A 值)×100%。

3.3 生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法(enzyme -linked immunosorbent assay，ELISA)测定细胞上清液中ADMA 含量温育后，加入生物素标记的抗ADMA抗体，再与链霉素和-HRP 结合，形成免疫复合物，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中ADMA 的浓度呈正相关。因此，根据标准品的浓度及对应的A 值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的A 值在回归方程上计算出对应的浓度，即为样品中ADMA 的含量。

3.4 硝酸还原酶法测定细胞培养上清液中NO 含量

人体内的NO 性质活泼，代谢释放后很快转变成代谢产物NO2-和NO3-，且NO2-又进一步转化为NO3-。血清NO3-与NO2-浓度之和(NO3-+NO2-)才能准确代表体内NO 水平。因此，收集对数期(80%～90%融合状态的)细胞，胰酶消化，以60% ～70%融合的密度铺板。置95%O2、5%CO2、37 ℃温箱培养使细胞贴壁，细胞达到同步化后，根据实验设计建立模型组，实验组中加入不同浓度的药物作用1 h后，再加入LPC 作用24 h 检测。本测定方法是利用硝酸还原酶特异性将NO3-还原成NO2-，并按照试剂盒的操作方法进行，通过显色深浅，利用紫外分光光度计测定吸光度值，再计算其浓度的高低。计算公式:

3.5 Annexin V-FITC/PI 荧光双染色法测定细胞凋亡率在进行完细胞凋亡刺激后(细胞数量不应低于1×105个)，把细胞培养液吸出至一合适离心管内，用PBS 洗涤细胞1 次，用不含EDTA 的胰酶消化，吸除消化液，收集细胞，加入上一步骤中的培养液，稍混匀，转移到离心管内，高速离心机离心(2 000 r/min)5 min，弃上清，收集细胞(1 ～5)×105个，用PBS 洗涤细胞，并用高速离心机离心(2 000 r/min)5 min，弃上清。每管中加入500 μL binding buffer 轻轻悬浮细胞后。每管中加入5 μL Annexin V-FITC 混匀后，室温避光孵育10 min，再加入5 μL propidium iodide，混匀。在室温下避光反应5 ～10 min 后，应在1 h 内进行流式细胞仪检测(激发波长Ex=488 nm，发射波长Em=530 nm)。

4 统计学处理

使用SAS 8.1 统计软件包进行统计学处理，数据以均数±标准差(±s)表示进行方差分析，各组间两两比较使用SNK 法，以P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

结果

1 MTT 结果

LPC(10 mg/L)损伤组HUVECs 共孵育24 h后，能显著降低细胞的存活(P ＜0.05);TSG+LPC 组中预先使用TSG(10.0、1.0、0.1 μmol/L)作用于HUVECs 1 h，各组均能阻止LPC 所致HUVECs 损伤(P＜0.05)，而且均能升高其存活率(P ＜0.05)，见图2。

Figure 2. Comparison of the cell survival rates in different groups. ± s. n =10. #P ＜0. 05 vs control;* P ＜0.05 vs LPC.图2 各组细胞存活率的比较

2 生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法检测结果

LPC(10 mg/L)损伤组HUVECs 细胞共孵育24 h 后，能显著升高细胞内ADMA 水平(P ＜0.05);TSG+ LPC 组中预先使用TSG(10. 0、1. 0 和0. 1 μmol/L)作用于HUVECs 1 h，各组均能阻止LPC 所致HUVECs 培养上清液ADMA 含量的增加，而且均能降低其含量(P ＜0.05)，见图3、表1。

Figure 3. Linear regression of ADMA detection.图3 细胞上清液中ADMA 含量的直线回归

表1 细胞上清液中ADMA 含量的比较Table 1. The content of ADMA in the supernatants of HUVECs(±s.n=9)

#P ＜0.05 vs control;* P ＜0.05 vs LPC.

Group Concentration of ADMA(ng/L)Control 1 056.2 ±73.3 LPC(10 mg/L) 2 637.3 ±65.3#LPC+ TSG(10.0 μmol/L) 263.4 ±25.7*LPC+ TSG(1.0 μmol/L) 593.0 ±33.5*LPC+ TSG(0.1 μmol/L) 629.4 ±38.8*

3 细胞培养上清液中NO 的含量测定结果

LPC(10 mg/L)组HUVECs 细胞共孵育24 h后，能显著减少细胞培养上清液中NO 的含量(P ＜0.05);与LPC(10 mg/L)组比较，TSG+LPC 组中预先使用TSG(10.0、1.0 和0.1 μmol/L)作用于HUVECs 1 h，各组均能阻止LPC 所致HUVECs 细胞培养上清液NO 含量的减少，而且均能升高其含量(P＜0.05)，并显示一定的浓度依赖性，见表2。

4 Annexin V－FITC/PI 荧光双染色法测定细胞凋亡结果

LPC(10 mg/L)损伤组与HUVECs 共孵育24 h后，能显著增加细胞的凋亡(P ＜0.05);TSG +LPC组使用TSG(10.0、1.0 和0.1 μmol/L)作用于HUVECs l h 后，均能阻止LPC 所致HUVECs 凋亡率的增加(P ＜0.05)，见图4、表3。

表2 细胞上清液中NO 含量的比较Table 2. The content of NO in the supernatants of cultured HUVECs(±s.n=8)

#P ＜0.05 vs control;* P ＜0.05 vs LPC.

Group Concentration of NO(μmol/L)Control 69.63 ±3.64 LPC(10 mg/L) 37.85 ±3.40#LPC+ TSG(10.0 μmol/L) 58.85 ±3.69*LPC+ TSG(1.0 μmol/L) 51.76 ±3.40*LPC+ TSG(0.1 μmol/L) 45.65 ±3.13*

Figure 4. Flow cytometric detection of apoptosis(×200).图4 流式细胞仪检测细胞凋亡的结果

表3 细胞凋亡率的比较Table 3. The comparison of HUVECs apoptosis(±s.n=3)

#P ＜0.05 vs control group;* P ＜0.05 vs LPC group.

Group Apoptotic rate(%)Control 5.44 ±0.87 LPC(10 mg/L) 21.87 ±1.37#LPC+ TSG(10.0 μmol/L) 5.67 ±0.93*LPC+ TSG(1.0 μmol/L) 14.63 ±1.52*LPC+ TSG(0.1 μmol/L) 20.13 ±1.15*

讨论

LPC 作为氧化低密度脂蛋白(oxidized low -density lipoprotein，ox-LDL)的主要活性成分，可抑制血管内皮细胞的增殖活性并诱导其发生凋亡，它能够诱导内皮细胞细胞集落刺激因子、黏附分子、血管平滑肌生长因子以及单核细胞趋化蛋白-1 等多种蛋白分子表达，从而促进单核细胞与动脉内膜的迁移、黏附，通过促进巨噬细胞清道夫受体摄入ox -LDL，引起血管壁泡沫细胞的堆积和脂纹的形成［4］，研究还发现以10 mg/L LPC 可以诱导内皮细胞损伤，其细胞培养上清液中丙二醛显著升高，而NO 含量显著减少［5］。因此，LPC 常被用作研究血管内皮细胞损伤模型的工具试剂，本实验与上述研究结果相一致。

ADMA 是一种内源性NOS 抑制剂，可以竞争性抑制NOS 活性，减少NO 的生成，通过影响NO 合成而导致血管内皮功能障碍［2］。目前已有证据证实ADMA 是心血管疾病的新的危险因子，与内皮功能不全和动脉粥样硬化程度密切相关［6］。最近研究表明ADMA 与L-精氨酸竞争性抑制NO 的合成，在调节NO 合成中具有重要作用，Böger 等［7］证实高胆固醇血症家兔的血浆中ADMA 浓度明显升高，而NO的含量明显降低。赵雷等［8］研究结果证实不同剂量ADMA 对HUVECs 产生的NO 有明显抑制作用，而且HUVECs 表面细胞间黏附分子-1 和血管细胞黏附分子-1 的表达水平明显增高。同时，ADMA 可明显降低HUVECs 的黏附性能和细胞数目，并对内皮细胞的结构形态有所改变。

在AS 病变发展过程中，内皮功能受损，内皮源性cNOS 表达或活性下降，内皮源性NO 产生减少，而VSMCs 表达的iNOS 活性增加，产生大量NO 自由基，刺激细胞凋亡和胶原组织降解，促进AS 的形成［9］。NO 是由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化L-精氨酸脱胍基而产生的，它广泛参与机体多种生理功能的调节，有舒张血管，抑制平滑肌细胞增殖和血小板聚集，减少白细胞黏附，减轻内皮细胞损伤等作用［10］。NO 合成减少将导致内皮功能障碍，受损内皮细胞合成NO 减少，从而形成恶性循环，导致AS 的发生发展。有研究显示在动脉粥样硬化发生与发展过程中，NO 是一种反映血管内皮细胞功能损伤的重要敏感标志物之一，被称为内源性的抗动脉粥样硬化分子［11］。正常情况下，内皮细胞释放的NO 具有重要的血管保护作用。本研究结果显示:TSG 明显升高经LPC 诱导后HUVECs 中NO 的量。

细胞凋亡也称为程序性细胞死亡，是由基因控制的、细胞主动的、受到严密调控的死亡过程，动脉粥样硬化的启动与细胞凋亡有着密切联系。细胞凋亡是多种疾病产生的重要原因之一，内皮细胞凋亡增加不仅可以造成血管内皮结构的损害，而且还严重影响了内皮细胞的正常功能，降低了血管内皮在调控血管张力、血管通透性、凝血、血流、血栓溶解上的作用，从而诱发了血管病变的进一步发生［4］。血管内皮细胞凋亡对AS 的发生与发展具有重要意义［12］。Tzeng 等［13］的研究已经证实了NO 能够抑制内皮细胞凋亡，而对AS 起保护作用。

本研究发现，TSG 可以抑制LPC 刺激HUVECs ADMA 的释放和细胞的凋亡，同时可增加NO 的含量及细胞存活的时间，可以推测TSG 通过影响内源性NOS 抑制剂ADMA，增加NOS 活性，促进NO 生成，减少细胞凋亡，而对AS 起保护作用。

综上所述，TSG 对LPC 诱导血管内皮细胞损伤的保护作用是通过抑制内源性NOS 抑制剂ADMA，而增加NOS 活性，促进NO 的生成得以实现，同时，可能存在其它作用机制有待进一步研究。

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