白菜叶片挥发成分多样性及对黑斑病菌孢子萌发的影响

万秀娟，范黎明，叶 敏，赵 艳，王 亮

云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室，昆明 650201

白菜(Beassica pekinensis)属十字花科芸薹属芸薹种，是我国北方冬季的主要蔬菜。近年来，随着白菜黑斑病的逐渐流行，白菜的质量和产量受到了严重的影响。已有研究表明植物挥发性成分，对植食性昆虫和植物抗病均有一定影响［1-4］。甜脆绿、瓢儿白、83-1和优早四号是云南省常见的四个栽培品种，经过田间观察发现，栽培于同一地块的四个白菜品种，对白菜黑斑病的抗病性表现出显著差异。室内人工接种试验表明，接种后四个品种白菜发病的病情指数为83-1＞优早四号＞甜脆绿＞瓢儿白，该实验结果与田间观察到的结果一致。本文通过使用GC-MS联用技术和悬滴培养法，研究了4种不同品种白菜的叶面挥发性成分对白菜黑斑病菌孢子萌发的影响。研究结果对利用农业生物多样性控制作物病害的原理，指导白菜黑斑病的防治，具有重要的现实意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试白菜:两个抗病品种甜脆绿和瓢儿白;两个感病品种83-1和优早四号种子(均购于昆明市官渡区佰利种子园)经10%次氯酸钠消毒催芽后，播种于无虫网室的苗盘中，统一肥水管理。

供试病原菌 白菜黑斑病菌(Alternaria brassicae)为云南省植物病理重点实验室保藏菌种。

1.2 实验方法

分别选取9～10叶期的四个健康白菜品种去根称取300 g，分置在盛有40 mL重蒸正己烷的12 cm培养皿中漂洗2 min后收集漂洗液［5］，经无水硫酸钠(A.R，上海化学试剂一厂)脱水后过滤，用氮吹以400 mL·min-1的流速浓缩至0.6 mL，制备所得漂洗液密封保存于-20℃的冰箱中。

分别吸取上述四种白菜漂洗液1、5、10、15、20 μL(15 μL以下的漂洗液分别加重蒸正己烷定溶至20 μL)，用含有1%葡萄糖和0.5‰的吐温-20的无菌蒸馏水，制成浓度为1×106个·mL-1的孢子悬浮液，采用悬滴培养法［6］，3 h后测定白菜漂洗物对孢子萌发的抑制率(孢子萌发已超过孢子长度1/2为准)，在20 μL重蒸正己烷中加入与处理相同的葡萄糖和吐温-20作为溶剂对照，在20 μL灭菌蒸馏水中加入与处理相同的葡萄糖和吐温-20作为空白对照，实验重复3次。

孢子萌发率和抑制率的计算公式:

1.3 气相色谱-质谱联用仪分析条件

Agilent 6890/5975型气质联用仪(美国Agilent公司)，NIST 05谱库。色谱条件:HP-5MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美国Agilent公司);程序升温:初温35℃，保持2 min，以4℃· min-1升至200℃后10℃·min-1升至250℃，保持10 min;载气为高纯氦气(99.999%，昆明梅赛尔气体有限公司)，流速1.0 mL·min-1;无分流进样，进样量1.0 μL。质谱条件:EI离子源，电子能量70 eV，扫描范围50－550 amu，四极杆温度150℃，离子源温度230℃，接口温度280℃，EM电压1400 V，溶剂延迟6.0 min。面积归一化法计算各成分相对含量。

1.4 数据分析

数据采用SPSS17.0统计软件进行数据分析，结合Student-Newman-Keuls检验进行单向ANOVA分析，比较不同处理间数据的差异显著性和重复间的离散度。

2 结果与分析

2.1 白菜挥发物化学成分分析

应用GC-MS技术对四种白菜漂洗物进行化学成分分析，四种白菜漂洗物的总离子流图(图1-4)。四种白菜漂洗物中共检测出14种挥发性组分，甜脆绿、瓢儿白、83-1和优早四号漂洗物中挥发性成分分别为10种、7种、8种和7种。其中甜脆绿漂洗物中的主要挥发性成分为2，2，4，6，6-五甲基庚烷，相对含量为17.15%;瓢儿白、83-1和优早四号漂洗物中的主要挥发性成分为反-3-己烯醇，相对含量分别为15.76%、10.87%、7.21%。2，4，6，8-四甲基十一碳烯和2，4，6-Tritert-butyl-4-methyl-2，5-cyclohexadien-1-one仅在83-1漂洗物中检测到;2，4-二甲基-1-庚烯、反-2-己烯醛、2，2，4，4-四甲基辛烷和3，5-二甲基辛烷仅在甜脆绿漂洗物中检测到。6，6-二甲基富烯、2，2，4，6，6-五甲基庚烷、1，3，8-对-薄荷三烯和1，2-二乙基苯为四种白菜所共有(表1)。

图3 83-1漂洗物叶面总离子流图Fig.3 TIC of 83-1 leaf surface rinse

图4 优早四号叶面漂洗物总离子流图Fig.4 TIC of You zao si hao leaf surface rinse

表1 不同白菜品种挥发性组分及其相对含量Table 1 Volatile compounds and their relative percentage contents from different variety of Chinese cabbage rinses

图5 四种白菜漂洗物主要挥发性组分相对含量的比较Fig.5 The relative percentage contents of main volatile compounds form different variety of Chinese cabbage rinses

顺-3-己烯醛在甜脆绿漂洗物中的相对百分含量显著高于其在其它三种白菜漂洗物中的相对百分量;反-3-己烯醇在瓢儿白漂洗物中的相对百分含量显著高于其在其它白菜漂洗物中的相对百分含量。2，2，4，6，6-五甲基庚烷在甜脆绿漂洗物中的相对百分含量显著高于其在其它三种白菜漂洗物中的相对百分含量;1，3，8-对-薄荷三烯和1，2-二乙基苯的相对百分含量在甜脆绿、瓢儿白和优早四号漂洗物中无显著性差异(图5)。

2.2 白菜叶面漂洗物对链格孢菌孢子萌发的影响

溶剂对照组的病原孢子在培养3 h后，孢子萌发率大于96%，与空白对照相比无显著差异(P＞0.05)。试验结果表明，相同浓度的不同品种白菜叶面漂洗物，对黑斑病菌孢子萌发的影响差异显著(P＜0.05);相同品种的白菜叶面漂洗物，其浓度与病原菌孢子萌发抑制率成正相关，经不同浓度叶面漂洗物处理的病原菌孢子，其萌发抑制率间差异显著(P＜0.05)，其中浓度为20 μL的瓢儿白叶面漂洗物，对黑斑病菌孢子萌发的抑制率最高。4个品种不同浓度的叶面漂洗物对黑斑病菌孢子萌发的抑制活性，如图6所示。

图6 4个品种不同浓度的白菜叶面漂洗物对黑斑病菌孢子萌发的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of four variety Chinese cabbage leave surface rinses to A.brassicae spore germination at different concentrations

当浓度为1 μL时，各品种漂洗物对黑斑病菌孢子萌发的抑制率均无显著差异(P＞0.05)，当浓度大于10 μL时，四种白菜漂洗物对病原菌孢子的抑制率低依次排列为:瓢儿白＞甜脆绿＞优早四号＞83-1，且各品种漂洗物对黑斑病菌孢子萌发的抑制率表现出显著差异(P＜0.05)。瓢儿白漂洗物在浓度为5 μL时，对黑斑病菌孢子萌发的抑制率为60%，而甜脆绿和优早四号漂洗物则分别要浓度为15 μL和20 μL，对黑斑病菌孢子萌发的抑制率才能达到瓢儿白漂洗物5 μL的水平，瓢儿白漂洗物在20 μL浓度下，对黑斑病菌孢子萌发的抑制率超过90%。

图7 不同品种白菜叶面漂洗物对黑斑病菌孢子萌发的抑制作用Fig.7 Inhibitory effect of different variety Chinese cabbage leave surface rinses to A.brassicae spore germination at concentration of 15 μL

3 讨论与结论

植物挥发性物质对植物病原真菌的影响已有报道，广玉兰叶乙醇提取物以及其不同溶剂萃取层对植物病原真菌有抑制作用［7］，西班牙樱桃叶的甲醇和乙醇提取物对多种病原真菌都有明显的抑制作用［8］。本研究结果表明:采用漂洗的方法得到的四种白菜叶面的漂洗物对黑斑病菌孢子萌发均有一定的抑制作用，这与前人发现的挥发性物质对病原菌有抑制作用的研究结果相一致。

对四种白菜叶面漂洗物进行成分分析，共检测到14种化合物，初步鉴定了13种，其中醛类、烯类、醇类、烷烃和酮类共12种。主要化合物有反-2-己烯醛和反-3-己烯醇，该结果与吴春燕［9］等人在对12种大白菜进行的检测所得到的相对含量较高的组分为2-己烯醛、3-己烯醇(Z/E)的结果相一致。

本研究结果表明:四种白菜漂洗物对黑斑病菌孢子萌发均有抑制作用，高浓度时四种白菜叶面漂洗物对病原菌抑制活性的顺序为:瓢儿白＞甜脆绿＞优早四号＞83-1，且各品种漂洗物对孢子萌发的抑制率存在显著差异。

在4种白菜漂洗物中，相同浓度时，瓢儿白漂洗物对黑斑病菌孢子萌发的抑制率最高，经GC-MS检测分析瓢儿白漂洗物中含有的反-3-己烯醇含量显著高于其它三种白菜漂洗物。Croft研究表明，在菜豆受假单孢菌侵染时，抗病植株中的反-2-己烯醛、反-3-己烯醇的含量是易感病植株的17和16倍［10］。而瓢儿白漂洗物对黑斑病菌孢子萌发的抑制率显著高于其它三种白菜漂洗物对黑斑病菌孢子萌发的抑制率，这可能与其含有的反-3-己烯醇有关。甜脆绿漂洗物中检测到反-2-己烯醛，而在其它三种白菜漂洗物中均未检测到，有报道表明反-2-己烯醛对植物病原菌有抑制作用，如番茄叶释放的挥发物质反-2-己烯醛、己烯醛、反-2-壬烯醛、壬烯醛2-蒈烯和柠檬烯对病原真菌链格孢菌及灰葡萄孢菌均有一定的抑制作用［11，6］，反-2-己烯醛还可以降低梨青霉病的发病［12］。而甜脆绿漂洗物对黑斑病菌孢子萌发的抑制率显著高于83-1和优早四号漂洗物对黑斑病菌孢子萌发的抑制率，这可能与其含有反-2-己烯醛有关。

顺-3-己烯醛在甜脆绿漂洗物中的含量显著高于其在其它三种白菜漂洗物，而在高浓度条件下，瓢儿白漂洗物对黑斑病菌孢子萌发的抑制率显著高于其它三种白菜漂洗物对黑斑病菌孢子萌发的抑制率，说明该化合物可能与抑制黑斑病菌孢子萌发无关。2，4-二甲基-1-庚烯、2，2，4，4-四甲基辛烷和3，5-二甲基辛烷三种组分仅在甜脆绿漂洗物中检测到;而在高浓度时，甜脆绿漂洗物对黑斑病菌孢子萌发的抑制率显著高于83-1和优早四号漂洗物对黑斑病菌孢子萌发的抑制率，说明这三种化合物是抑制孢子萌发的疑似化合物。2，4，6，8-四甲基十一碳烯和2，4，6-Tritert-butyl-4-methyl-2，5-cyclohexadien-1-one两种挥发性组分仅在感病品种83-1漂洗物中检测到，而83-1漂洗物对黑斑病菌孢子萌发的抑制率显著低于其它三种白菜漂洗物对黑斑病孢子萌发的抑制率，说明这两种化合物可能与诱导黑斑病菌孢子萌发有关。

6，6-二甲基富烯、2，2，4，6，6-五甲基庚烷、1，3，8-对-薄荷三烯和1，2-二乙基苯为四种白菜所共有。6，6-二甲基富烯在甜脆绿和瓢儿白漂洗物中的含量与在83-1和优早四号漂洗物中的含量均无显著差异，而在高浓度时，甜脆绿和瓢儿白漂洗物对黑斑病菌孢子萌发的抑制率显著高于83-1和优早四号漂洗物对黑斑病孢子萌发的抑制率，说明这四种白菜漂洗物对黑斑病菌孢子萌发的影响可能与该物质无关。1，3，8-对-薄荷三烯和1，2-二乙基苯在瓢儿白漂洗物中的含量与其在83-1漂洗物中的含量无显著性差异，而在高浓度时，瓢儿白漂洗物对黑斑病菌孢子萌发的抑制率显著高于83-1漂洗物对黑斑病菌孢子萌发的抑制率，说明1，3，8-对-薄荷三烯和1，2-二乙基苯两种化合物可能与抑制黑斑病菌孢子萌发无关。2，2，4，6，6-五甲基庚烷在甜脆绿漂洗物中的含量显著高于在其他三种白菜漂洗物中的含量，而甜脆绿漂洗物对黑斑病菌孢子萌发的抑制率也显著高于83-1和优早四号漂洗物对该病孢子萌发的抑制率，说明2，2，4，6，6-五甲基庚烷是抑制白菜黑斑病菌孢子萌发的疑似化合物。

因此，结合已有的研究报道，可推测各白菜漂洗物对黑斑病孢子萌发抑制率存在显著性差异，可能与它们漂洗物中含有2，2，4，6，6-五甲基庚烷、反-3-己烯醇、反-2-己烯醛、2，4-二甲基-1-庚烯、2，2，4，4-四甲基辛烷、3，5-二甲基辛烷、2，4，6，8-四甲基十一碳烯和2，4，6-Tritert-butyl-4-methyl-2，5-cyclohexadien-1-one这几种挥发性组分有关。但是，由于植物挥发性组分是复杂的混合物［4］，所以抑制白菜黑斑病菌孢子萌发的主要活性成分可能是某种化合物或某些化合物的集合，它们对白菜黑斑病菌孢子萌发的抑制效果是单独作用还是协同作用，尚待进一步研究。

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