青龙白虎利咽含片的提取工艺研究

2012-12-19闫莉傅超美季宁平廖婉罗妮妮

中药与临床 2012年5期

闫莉，傅超美，季宁平，廖婉，罗妮妮

青龙白虎汤出自清代著名医家王孟英《王氏医案》卷二，方由青果、生莱菔组成。青果素有清肺利咽、生津止渴之功；莱菔具有清热生津、凉血止血之功，两者合用，有清热解毒、宣肺利咽之功，此汤剂在现代中医药临床治疗中亦得到广泛应用。为使传统汤剂方便使用并进一步保证药效，将其改变剂型制成含片。

方中君药青果又名橄榄，《中国药典》历版均有收载[1]，既为可食鲜果，又为常用的传统利咽中药[2]，现代研究发现青果中含有较多的没食子酸和黄酮类化合物[3～4]。莱菔又名萝卜，在我国有1400多年用药历史，天然硫苷是其主要的特征性化学成分, 此外还含有脂肪酸、色素和一些酚酸类成分[5]。本试验根据药物的性质，采用正交试验设计优选提取工艺，采用高效液相色谱法及紫外可见分光光度法分别测定提取工艺中指标性成分没食子酸和总黄酮的含量，以没食子酸含量、总黄酮含量、干膏收率为考察对象进行综合评分，确定青龙白虎利咽含片最佳提取工艺条件，从而为青龙白虎利咽含片的成型工艺研究提供试验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent1200高效液相色谱仪（Agilent1200二极管阵列检测器，Agilent1200色谱工作站）（美国安捷伦科技有限公司）；Diamonsil TM C18色谱柱（250×4.6mm，5 µm，美国迪马公司）； Mettler AE240 十万分之一电子分析天平（德国Mettler公司）；FA1104万分之一电子分析天平（上海天平仪器厂）；756PC紫外可见分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；数显恒温水浴锅HH-4(国华电器有限公司) ；粉碎机（DJ灵巧型，上海淀久中药机械制造有限公司）；DGG-9240电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）。

1.2 材料

青果饮片（购于四川泸州百草堂中药饮片有限公司，批号：120611-1），经鉴定为橄榄科植物橄榄Canarium album Raeusch.的干燥成熟果实；市购新鲜白萝卜；没食子酸对照品（购于中国药品生物制品检定所，批号：0831-201201，供含量测定用)；芦丁对照品（购于中国药品生物制品检定所，批号：0080-201205，供含量测定用)；甲醇为色谱纯（美国Fisher公司），水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 正交试验设计

根据预实验结果，对影响该工艺的主要因素：加水量、煎煮时间、煎煮次数, 用L9(34)正交试验表进行优选。以没食子酸含量、总黄酮含量、干膏收率为考察指标；各指标的权重评分为，干膏收率占30分，没食子酸含量占35分，总黄酮含量占35分，总分为100分。因素与水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 The design of L9(34) orthogonal test

2.2 干膏收率的测定

取青果细粉10 g，萝卜鲜品打成浆10 g，共20 g，平行取9 份，依次按照正交试验表中确定的试验条件操作，将所得药液滤过，滤液定容至250mL量瓶中，精密吸取25mL滤液于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴挥干，残渣于105 ℃烘箱干燥3 h，取出，移至干燥器中，冷却30分钟，迅速称重，计算干膏收率。

2.3 没食子酸含量测定

2.3.1 色谱条件 Diamonsil TM C18色谱柱（250×4.6mm，5 µm）；流动相:甲醇-0.5%冰乙酸（7:93），检测波长271 nm，柱温30 ℃。理论塔板数按没食子酸峰计应不低于2000。见图1。

图1 阴性对照（A）、没食子酸对照品（B）、样品（C）的HPLC色谱图Fig 1 HPLC Chromatogram of Blank solvent（A）Gallic acid control（B）and Sample（C）

2.3.2 对照品与供试品溶液的制备精密称取没食子酸对照品适量，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成0.2680mg﹒mL-1的对照品溶液。

取青果细粉10 g，萝卜鲜品打成浆10 g，共20 g，平行取9 份，依次按照正交试验表中确定的试验条件操作，将所得药液滤过，滤液定容至250mL量瓶中，将滤液用微孔滤膜过滤即得供试品溶液。

2.3.3 阴性对照溶液的制备以缺青果药材的处方为阴性对照，并按2.3.2项下供试品溶液的制备制得阴性对照溶液。

2.3.4 线性考察分别精密吸取没食子酸对照品溶液2，4，6，8，10μL注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定，记录色谱图，测定峰面积，以峰面积平均值（y）对进样量（x）进行线性回归，绘制标准曲线，计算得到回归方程为y =3024x + 54.039，r=0.9999，没食子酸在0.5360～2.680mg﹒mL-1范围呈良好的线性关系。

2.3.5 精密度试验精密吸取没食子酸对照品溶液，连续进样6次，RSD值为0.82%，表明试验所用仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性试验精密吸取供试品溶液分别于0，2，4，6，8，12，18 h进样10μL，测定峰面积，RSD值为0.56%。结果表明样品在18 h内稳定性良好。

2.3.7 重复性试验精密称取各味药各10 g，共5份，分别用水煎煮，提取液用微孔滤膜滤过即得供试品溶液，依法测得没食子酸的平均含量为1.61mg﹒mL-1，RSD值为0.89%。

2.3.8 加样回收率试验精密量取已知含量的样品溶液1mL（0.1291mg﹒mL-1），共6份，分别精密加入没食子酸对照品溶液1mL，按供试品制备方法及色谱条件，测定含量，计算平均加样回收率为99.73%，RSD值为1.89%，表明本品回收率符合要求。结果见表2。

表2 加样回收率试验结果(n=3)

2.3.9 样品测定取供试品溶液各10μL, 注入液相色谱仪, 测定, 即得。

2.4 总黄酮含量测定

2.4.1 对照品与供试品溶液的制备精密称取芦丁对照品适量，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成0.0238mg﹒mL-1的对照品溶液。

取青果细粉10 g，萝卜鲜品打成浆10 g，共20 g，平行取9 份，依次按照正交试验表中确定的试验条件操作，将所得药液滤过，滤液定容至250mL量瓶中，将滤液离心后即得供试品溶液。

2.4.2 标准曲线的制备分别移取上述配制好的芦丁对照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5mL于10mL量瓶中，加水至5mL，依次加入5%亚硝酸钠试液0.4mL，放置5min，10%硝酸铝试液0.4mL，放置5min，4%氢氧化钠试液4mL ，加水至刻度，混匀，放置15min 后，以相应试剂做空白，于507 nm处测定吸光度，以对照品质量浓度(C)与吸光度(A)进行直线回归，得回归方程: Y = 101.18X +0.0168 ( r = 0.9995)，在0.00119～0.00595mg﹒mL-1内呈良好的线性。

2.4.3 精密度试验精密吸取芦丁对照品溶液，按“2.4.2项”方法显色后，连续进样6次，RSD值为1.02%，表明试验所用仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验取同一供试品溶液，按2.4.2项方法显色后，分别在0，15，30，45，60min 测定A 值。结果表明供试品溶液显色后在1 h 内稳定，RSD = 0.68%。

2.4.5 重复性试验精密称取各味药各10 g，共5份，分别加水煎煮，提取液滤过即得供试品溶液，按“2.4.2项”方法显色后，测得总黄酮的平均含量为0.3712mg﹒mL-1，RSD值为0.99%。

2.4.6 加样回收率试验精密量取已知总黄酮量的样品液6 份（0.0300mg﹒mL-1）1mL，各分别加入芦丁对照品溶液( 0.0238mg﹒mL-1) 1mL，按“2.4.2项”方法显色，在507 nm 处测定吸光度，计算回收率，平均回收率为100.00%，RSD值为0.99%。见表3。

表3 加样回收率试验结果(n=3)

2.4.7 样品含量测定取供试品溶液1mL，按“2.4.2项”方法显色，以供试品溶液为空白，在507 nm 波长处测定A 值，计算含量。

2.5 试验结果

依次测定每组没食子酸及总黄酮含量、干膏得率, 试验结果和结果分析见表4、表5。

表4 正交试验结果

结果表明：根据综合评分结果，由直观分析可得影响提取效果的因素大小为：煎煮次数(C)>煎煮时间(B) >加水量(A)；对实验数据进行方差分析结果表明，煎煮次数对没食子酸、总黄酮量及干膏收率有显著性影响，煎煮时间和加水量对没食子酸、总黄酮得量及干膏收率无显著性影响。综合直观分析和方差分析结果，结合工业化大生产节约能效、降低生产成本考虑，确定最佳提取工艺为A1B1C2，即加8倍量水，煎煮2次，每次1小时。

2.6 验证试验

按正交试验筛选出的最佳提取工艺，重复试验三次，结果没食子酸平均含量为1.922mg﹒g-1，总黄酮平均含量为0.4891mg﹒g-1，干膏收率为19.21%。三者的RSD值依次为0.11%，0.19%，0.15%，表明所确定的最佳工艺稳定，合理可行。

3 讨论

3.1 指标性成分的选择

在确定提取工艺的评价指标时，因方中主药青果在《中国药典》2010版中无含量测定指标要求，而没食子酸作为青果中最主要且含量较多的有效成分，对多种致病菌有抑制作用，同时有抗炎、抗肿瘤、保肝之效，所以作为指标性成分之一，考虑到此成分的专属性不强且主要由鞣质水解而来，定量分析会产生波动，本试验还选用青果中具有抑菌抗炎药理活性的总黄酮成分作为指标。