胃癌组织中Src激酶激活和HER2、Ki-67的表达及相关性研究

王永辉 陈 敬 沈 朋＊ 毛卫波 周月芬

胃癌组织中Src激酶激活和HER2、Ki-67的表达及相关性研究

王永辉1，2陈 敬1沈 朋1＊毛卫波3周月芬2

（1浙江大学医学院附属第一医院肿瘤内科，杭州310003；2浙江省丽水市中心医院肿瘤内科，3病理科，丽水323000）

目的 研究胃癌组织中非受体酪氨酸激酶c-Src激活形式p-Src（Y419）和HER2、Ki-67的表达及相互关系。方法 应用免疫组化法检测123例胃癌组织及56例癌旁组织p-Src（Y419）、HER2、Ki-67的表达，分析其临床病理意义和相互关系。结果 p-Src（Y419）在胃癌及癌旁组织中表达积分中位值分别为80和30，差异显著（P＜0.05），其表达强弱与肿瘤大小、分化程度、浸润深度、p TNM分期显著相关；HER2在胃癌组织中高表达率为39%，癌旁组织HER2无表达，差异显著（P＜0.05）；分化良好，肠型，单纯腺癌的胃癌组织HER2表达率高。Ki-67在胃癌及癌旁组织中标记指数范围分别为0-98%和0-20%，其中位值分别为70%和3.5%，差异显著（P＜0.05）。Ki-67表达高低与组织类型、Lauren分型、脉管癌栓显著相关，与分化程度有显著差异的趋势；胃癌组织中HER2表达与p-Src（Y419）、Ki-67表达呈正相关，而癌旁组织中无类似关系；胃癌及癌旁组织中p-Src（Y419）表达与Ki-67表达均呈正相关。结论 胃癌组织Src激活、HER2及Ki-67表达在胃癌中有重要的临床意义，可能作为胃癌生物学行为的标记物。胃癌中c-Src激活和HER2、Ki-67表达有一定的相关性。

胃癌；c-Src／p-Src（419）；HER2；Ki-67；免疫组织化学

胃癌是世界范围内最常见恶性肿瘤的第4位［1］，To GA试验［2］证实化疗联合药物赫赛汀治疗进展期胃癌可使患者中位生存期延长，但也仅有13.5个月。因此寻找新的治疗靶点一直是胃癌治疗研究中的重点。了解胃癌发生发展中的信号传导通路，对于寻找新的治疗靶点有着重要的指导意义。Src蛋白是鸡逆转录病毒v-Src在人体同源基因c-Src的蛋白产物，是非受体酪氨酸激酶Src超家族的一员，与肿瘤的发生、发展关系最为密切。HER2是由HER2癌基因编码的表皮生长因子家族成员，HER2有很强的催化激酶活性，且HER2异源二聚体有很强的信号功能［3］，可通过多个信号通路促进细胞增殖。Ki-67蛋白存在于除休眠或静止细胞的G0期以外的G1，S，G2和有丝分裂期［4］，可反映细胞的增殖状态。本研究检测123例胃癌术后组织标本及邻近的56例癌旁组织标本，探讨三者与临床病理参数之间及其相互关系。

材料和方法

1.一般资料

收集浙江大学医学院附属第一医院及浙江省丽水市中心医院2008年1月-2010年12月行胃癌根治性切除的组织标本123例及其中相应的癌旁组织标本56例。全部病例均经手术和病理证实，术前未行化疗或放疗，具有完整的病理资料。组织标本保存于病理科。所有标本均经40g／L缓冲中性福尔马林液固定，常规石蜡包埋，4μm厚度连续切片。123例病例中男性98例，女性25例；年龄36-81岁，中位年龄61岁；肿瘤直径0.5c m-12c m，中位直径4c m；贲门癌37例，非贲门癌86例；分化良好病例包括中高分化腺癌56例，分化不良病例包括低分化腺癌，未分化癌及粘液腺癌、印戒细胞癌及混有粘液腺癌或印戒细胞癌成分者共67例；Lauren分型包括肠型50例，弥漫型45例，混合型27例，未确定型1例；胃癌p TNM分期依据2010年出版的《AJCC癌症分期手册》，其中T120例，T222例，T327例，T454例；N053例，N117例，N228例，N325例；Ⅰ期32例，Ⅱ期34例，Ⅲ期57例，Ⅵ期0例。脉管癌栓定义为HE组织切片检查于血管或淋巴管内见癌细胞者，共26例。神经侵犯［5］11例，未见神经侵犯112例。

2.试剂

兔抗人p-Src（Y419）多克隆Ig G抗体（产品编号AF2685）购自美国R＆D公司。即用型免疫组化Envision染色试剂盒，即用型鼠抗人Ki-67单克隆抗体（克隆号K-2）及即用型鼠抗人HER2单克隆抗体（克隆号CB11）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

3.实验方法

采用免疫组织化学Envision二步法，石蜡切片经脱蜡，梯度酒精水化后，抗原热修复，用3%双氧水室温孵育20 min，消除内源性过氧化物酶的活性，p H 7.2磷酸盐缓冲液冲洗，加入一抗（p-Src（Y419）1∶20；HER2 1∶20；Ki-67 1∶75），37℃恒温水箱孵育1h，PBS冲洗，滴加试剂Envision T M通用型二抗50μl，置于37℃恒温水箱孵育25-30 min。DAB显色，苏木素复染，封片，镜检。所有抗体阴性对照以PBS代替第一抗体。Ki-67和HER2抗体阳性对照选择已知阳性标本为对照。

4.结果判定

p-Src（Y419）阳性判断标准及阳性对照参照文献报道的恶性间皮瘤［6］：以细胞浆或细胞膜出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性，染色的强弱以0-3表示，染色范围以0-100表示，通过染色强度和染色范围相乘得到染色积分（0-300），以染色积分大于中位数为高表达。HER2阳性判断以To GA研究［2］中采用的评价标准，并将HER2免疫组化3＋和2＋视为高表达。Ki-67阳性以细胞核呈棕黄色为阳性，每张切片选取3个高倍视野，显微镜下每个视野计数1000个细胞中的阳性细胞，其百分率的平均值为标记指数，用百分比表示，以大于等于50%为高表达。免疫组化结果由两位病理医师采用双盲法读片评定。

5.统计学方法

采用SPSS16.0软件进行数据分析。无序分类资料用χ2检验，单向有序分类资料及偏态资料采用秩检验，三者之间的关系采用Spear man等级相关并予曲线拟合，以P＜0.05为有统计学意义，P＜0.01有显著统计学意义。

结 果

1.胃癌组织及 癌旁组织 中 p-Src（Y419）、HER2、Ki-67的表达

p-Src（Y419）癌基因蛋白在胃癌细胞中呈棕黄色颗粒，主要定位于细胞浆，其低、中、高表达强度分别为57.7%，23.6%和6.5%，表达范围为0-99%，中值为75%；表达积分范围0-297，中值为80。癌旁组织P-Src（Y419）癌基因蛋白为无表达或低表达，表达率38%，表达积分1-90，中值30，差异显著（P＝0.000）（图1A，1B）；胃癌组织中 HER2在胃癌细胞中呈棕黄色颗粒，定位于细胞膜，1＋、2＋、3＋分别为35%，27.6%和11.4%，癌旁组织 HER2无表达，具有显著差异（P＝0.000）；（图2 A，2B）；Ki-67蛋白呈棕黄色颗粒定位于细胞核，Ki-67在胃癌及癌旁组织中标记指数范围分别为0-98%和0-20%，其中位值分别为70%和3.5%，差异显著（Z值＝-9.97，P＝0.000）（图3 A，3B）。

2.胃癌组织p-Src（Y419）、HER2、Ki-67表达与临床病理参数之间的关系

Src激活与肿瘤大小、分化程度、浸润深度、分期显著相关；分化良好、肠型、单纯腺癌的癌组织HER2表达率显著增高。Ki-67高表达与单纯腺癌、Lauren分型、脉管癌栓显著相关，与分化程度有显著差异的趋势（见表1）。

表1 123例胃癌组织中 HER2、p-Src（Y419）、Ki-67的表达与临床病理参数的关系Table 1 Correlation of HER2，p-Src（Y419），Ki-67 expression to clinicopathologic characteristics of 123 patients in gastric cancer

3.胃癌组织中 HER2表达与p-Src（Y419）、Ki-67表达之间的关系

胃癌HER2表达与p-Src（Y419）表达积分呈正相关，（rs＝0.429，P＝0.000）；HER2表达与 Ki-67表达百分比呈正相关（rs＝0.253，P＝0.005）；胃癌p-Src（Y419）表达积分与 Ki-67表达百分比呈正相关（rs＝0.426，P＝0.000）。（图4A-C）

图4 A HER2和Ki-67的关系图4B HER2和Src的关系图4C Src和Ki-67的关系Fig.4 A The relationship of HER2 and Ki67 expressionFig.4 B The relationship of HER2 and p-Src（Y419）expressionFig.4 C The relationship of p-Src（Y419）and Ki-67 expression

4.癌旁组织p-Src（Y419）蛋白表达强度与 Ki-67表达之间的关系

癌旁组织中p-Src（Y419）蛋白表达强度与 Ki-67表达呈正相关（rs＝0.31，P 值＝0.02）。癌旁组织 HER2无表达，与p-Src（Y419）蛋白和 Ki-67表达不相关。

讨 论

Src蛋白是Src基因的表达产物，是SRC家族的成员，作为非受体酪氨酸激酶，其与肿瘤关系最密切。Src蛋白激活的主要途径［7，8］有负调节磷酸化位点Y530去磷酸化、缺失、突变；Src蛋白高亲和力肽竞争SH2／SH3域，介导分子置换，解除Src蛋白的自我抑制；正调节自身磷酸化位点Y419位点磷酸化。其中Y419位点的自磷酸化对于整个Src蛋白的完全激活至关重要。Src蛋白参与多种信号传导。目前发现Src蛋白在乳腺、胃等［9，10］多种肿瘤组织存在过表达或过度活化。Takekura等［11］发现在胃癌组织中，Src蛋白的激活有时和Src蛋白的表达并不一致。因此，Src功能的实现可能主要通过Src的激活。既往对胃癌组织Src蛋白激活的研究多采用免疫印迹法［11，12］，Masaki等［12］应用免疫印迹法在胃癌中测定Src激活发现分化好的组织Src激酶活性高，但未阐述Src激活与其他临床病理参数间的关系。Aligayer等［13］应用免疫复合物激酶法在结直肠癌中测定Src活性，发现Src激活水平与Duke′s分期、T分期和N分期有关。我们首次应用p-Src（Y419）多克隆抗体直接测定大样本胃癌组织及癌旁组织激活Src的含量，证实胃癌组织中较非癌组织Src显著激活，并与肿瘤大小、分化程度、浸润深度、分期显著相关，结论和既往研究［12，13］基本一致。

信号分子的异常表达或活化在肿瘤的发生发展中有着重要的作用。除非受体酪氨酸激酶通路外，受体酪氨酸激酶通路也在胃癌的发生发展过程中起到重要的作用。HER2是人细胞膜上存在的受体酪氨酸激酶，在HER家族中，HER2通过形成异源二聚体传递信号［3］，对许多生命活动有重要意义。目前HER2已阐明的致癌机制主要有：（1）HER2过表达促成HER2-EGFR二聚体增多，降低其胞吞降解，延长信号传导时间［14］。（2）与 HER3形成异源二聚体激活下游PI3 K／Akt信号途径，促进细胞迁徙、转化、增殖、生存［15］。（3）HER2过度表达使内皮细胞收缩，增宽细胞间隙，肿瘤细胞更易穿过细胞间隙而转移［16］。HER2在乳腺癌、卵巢癌、胃癌等许多肿瘤中过表达，以HER2为靶点的抗癌治疗取得了良好的效果。乳腺癌的临床试验［17］已经证实加用曲妥珠单抗（赫赛汀）可改善无病生存期和总生存期。胃癌的TOGA试验［2］也证实联合HER2拮抗剂可增强胃癌的治疗效果。武鸿美等［18］研究860例中国人胃癌HER2高表达率为15.7%，HER2＋＋＋者为9%。而我们的病例显示HER2高表达率（＋＋～＋＋＋）39%，其中HER2＋＋＋者为11.4%，略高于武鸿美等的病例，可能和单中心病例分布不同有关。我们研究结果显示HER2阳性与胃癌的分化程度，组织类型，Lauren分型显著相关，而与患者年龄、性别、肿瘤发生部位、临床分期无关，与武鸿美等研究基本一致。

Ki-67作为一种与增殖细胞相关的核抗原，其临床意义在胃癌研究中并不一致，De Manzoni等［19］研究56例胃癌根治术患者，发现 Ki-67与浸润深度、淋巴结转移、3年生存率无关，而Ki-67＞40%在68岁以上组患者和预后差有统计学意义。而Lee等［20］对245例胃癌组织进行Ki-67免疫组化标记发现，Ki-67标记指数低与肿瘤分化差、浸润深度及淋巴结转移有关。Ki-67增殖指数低较增殖指数高者有更差的预后。研究发现Ki-67高表达与肿瘤组织类型、Lauren分型、脉管癌栓显著相关，分化差者有Ki-67表达率低的趋势，与既往研究者的结果部分一致，其差异可能与病例数及病理类型组成不同有关，需进一步研究。

体内外研究发现HER2-Src在信号通路中相互影响。Luttrell等［21］在人乳腺癌细胞株中应用免疫印迹法发现包含Src区域SH2／SH3的融合蛋白可以和HER2共沉淀，认为Src和HER2是信号传导中不可分割的一部分。Tan等［22］在乳腺癌细胞株研究发现HER2可增加Src蛋白的翻译并使其稳定，而Src抑制剂或者Src显性失活突变体可以抑制HER2介导的肿瘤侵犯和转移。Ishizawar等［23］在体外实验中发现Src可增强HER2／HER3异源二聚体的形成，增加了受体的基础活性及神经生长因子结合HER3导致的活性，进而激活下游的效应分子。Wilson等［24］研究129例女性乳腺导管内原位癌，发现HER2阳性与Src活性和Ki-67表达呈正相关。Wiener等［25］应用免疫组化法研究15例晚期卵巢癌，发现Src激活与HER2过表达正相关，但没有统计学意义。目前尚无HER2-Src在胃癌中研究的相关报道。研究结果表明胃癌组织中HER2与Src激活、Ki-67表达正相关，有统计学意义，提示胃癌中HER2-Src信号通道促进了胃癌的增殖，其信号传导通路在胃癌的发生发展中有一定的作用。而癌旁组织中 HER2与Src不相关，P-Src（Y419）、Ki-67表达正相关，有统计学意义，说明Src激活尚存在旁路途径。

综上所述，胃癌中HER2、Ki-67表达和Src激活有着重要的临床意义，HER2-Src信号通道在胃癌的发生发展中起着一定的作用。近来，Zhang等［26］体内外研究乳腺癌，发现赫赛汀联合Src蛋白抑制剂可以克服并逆转肿瘤的先天和获得性耐药，由于胃癌中有相同的信号传导通路，是否有同样的治疗效果，Src激活在胃癌中是否为独立的预后因素，都值得进一步研究。

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图 版 说 明

图1 A p-Src（Y419）癌组织高表达 （Envision法，×100）

图1B 癌旁组织p-Src（Y419）低表达 （Envision法，×100）

图2 A HER2癌组织中高表达 （Envision法，×100）

图2B 癌旁组织HER2表达阴性 （Envision法，×100）

图3 A 胃癌组织Ki-67高表达 （Envision法，×100）

图3B 癌旁组织Ki-67表达阴性 （Envision法，×100）

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 A P-Src（Y419）highly expressed in the gastric cancer tissues（Envision T M×100）

Fig.1 B P-Src（Y419）low expressed in the tu mor-adjacent tissues（Envision T M×100）

Fig.2 A HER2 highly expressed in the gastric cancer tissues（Envision T M×100）

Fig.2 B HER2 expression negative in the tu mor-adjacent tissues（Envision T M×100）

Fig.3 A Ki-67 highly expressed in t he gastric cancer tissues（Envision T M×100）

Fig.3 B Ki-67 low expressed in the tu mor-adjacent tissues

（Envision T M×100）

Expression and corelation of activated c-Src protein tyrosine kinase，HER2 and Ki-67 in gastric cancer

Wang Yonghui1，2，Chen Jing1，Shen Peng1＊，Mao Weibo3，Zhou Yuefen2
（1Depart ment of Medical Oncology，The First Affiliated Hospital，College of Medicine，Zhejiang Universit y，Hangzhou 310003，China；2Depart ment of Medical Oncol ogy，3Depart ment of Pathology，Lishui Centr al Hospital，Lishui 323000，China）

Objective To st udy the expression of p-Src（Y419），the activated f or m of c-Src kinase，HER2，Ki-67 in gastric cancer，and explore t heir correlation.Met hods I mmunohistoche mical investigations were carried out to study the expression of p-Src（Y419），HER2 and Ki-67 and their correlation in 123 gastric cancer speci mens and 56 corresponding adjacent speci mens.Results The median of staining score of p-Src（Y419）in gastric cancer tissues and adjacent nontu morous tissues was 80 and 30，respectively，with a significant difference.Activated c-Src correlated wit h t u mor size，differentiation，depth of wall invasion，and p TNM classification.The high expression rate of HER2 was 39%in gastric cancer，while t here was no expression of HER2 in adjacent nontu morous tissues，and the difference was significant（P＜0.05）.High expression of HER2 correlated wit h t he well diff erentiated or intestinal type，and pure adenocarcinoma.The range of Ki-67 index in the t wo kinds of tissues was 0-98%and 0-20%，and the median Ki-67 index was 70%and 3.5%，respectivel y，which was significant.The high expression of Ki-67 significantly correlated wit h pure adenocarcino ma，intestinal type，and cancer e mbol us，and wit h well diff erentiated cancer tissues in a significant tendency.High expression of HER2 correlated with high levels of activated c-Src and Ki-67 expression in gastric cancer tissues.There was no such relationship in adjacent nont u morous tissues.High levels of activated c-Src correlated with high levels of Ki-67 expression in the t wo kinds of tissues.Conclusion Activation of c-Src and expression of HER2 and Ki-67 are of significance in gastric cancer.They shoul d be considered as mar kers of t he biological behavior of gastric caner.Furt her more，activation of c-Src may be associated with HER2 and Ki-67 expression.

Gastric cancer；c-Src／p-Src（419）；HER2；Ki-67；I mmunohistochemistr y

R735.2

A

10.3870／zgzzhx.2012.04.017

2012-03-12

2011-05-23

王永辉，男（1978年），汉族，主治医师。

＊通讯作者（To who m correspondence should be addressed）