可诱导共刺激分子在BXSB狼疮小鼠肾脏中的表达

王玮炜 黄安斌 杜 戎 刘宇宏 宋 优 沈凌汛 余立凯

可诱导共刺激分子在BXSB狼疮小鼠肾脏中的表达

王玮炜 黄安斌 杜 戎 刘宇宏 宋 优 沈凌汛 余立凯＊

（华中科技大学同济医学院附属协和医院风湿免疫科，武汉430022）

目的 观察可诱导共刺激分子（ICOS）在BXSB狼疮小鼠肾脏中的表达，探讨ICOS在狼疮肾炎发病机制中的潜在作用。方法 选取8周龄及16周龄雄性BXSB小鼠各6只，并以8周龄C57BL／6雄性小鼠6只为正常对照，用免疫组织化学及实时荧光定量PCR方法，检测ICOS在小鼠肾脏中的表达水平。结果 正常对照组C57BL／6小鼠肾组织ICOS染色少许肾小管细胞呈浅棕色；8周龄及16周龄BXSB小鼠肾脏组织ICOS强阳性表达，细胞呈深棕色着色，分布于肾小管。8、16周龄BXSB组小鼠肾组织内ICOS mRNA表达水平［（6.43±0.92），（9.48±1.30）］均较正常对照组（4.58±0.63）增加，差异有统计学意义（均P＜0.01）；16周龄BXSB组小鼠的ICOS mRNA表达水平较8周龄BXSB组增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 肾组织ICOS的分布及表达增加可能是BXSB小鼠狼疮肾炎发病的重要机制之一。

可诱导共刺激分子；狼疮肾炎；免疫组织化学；BXSB小鼠

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种慢性自身免疫疾病。它可累及各个系统和器官，但以肾为最常见。临床上有狼疮肾炎（l upus nephritis，LN）表现者，占45-85%。肾衰竭是SLE死亡的常见原因［1］。LN的发病机制不明，多数学者认为易感者免疫耐受性减弱，T细胞功能缺陷是SLE整个免疫系统紊乱的核心。抗原特异性T细胞的活化需要两个不同的信号，第一信号来自抗原肽-MHC分子组成的复合物与T细胞受体（T cell receptor，TCR）的相互作用；第二信号由抗原递呈细胞（antigen presenting cells，APC）表面表达的共刺激分子（costi mulator）传递给T细胞，该信号确保免疫应答在需要的条件下才能发生。可诱 导 共 刺 激 因 子 （inducible co-sti mulator f actor，ICOS）属于CD28／B7家族，是新近发现的表达于活化T细胞和效应性T细胞的共刺激分子。ICOS优势表达于活化的T细胞表面，可以促进活化T细胞的增殖和分化、细胞因子的分泌、调节Thl／Th2的极化、促进T细胞依赖的抗体产生［2］。在系统性红斑狼疮这类自身免疫性疾病中，一些参与T细胞活化和功能的共刺激因子与疾病活动的关系一直是业内关注的热点，并且ICOS可能成为自身免疫性疾病调控治疗的理想靶点［3］。本文以经典的BXSB狼疮小鼠肾脏为研究对象，用免疫组织化学及实时PCR方法，探索ICOS在狼疮肾损害的作用机制。

材料和方法

1.实验动物及分组

BXSB雄性小鼠是由美国Jackson实验室引进，北京大学医学部免疫学系提供。正常对照选取与BXSB小鼠同基因（syngeneie）的 C57BL／6（H-2b）小鼠，购自中国科学院遗传学研究所。在同济医学院SPF级动物中心，给予水和裸鼠饲料饲养。分别取8周龄正常C57BL／6雄性小鼠6只，以及8、16周不同周龄BXSB雄性小鼠各6只，共18只用于本实验。

2.主要试剂和仪器

实验主要试剂包括ICOS抗体（eBioscience，Catalog No.14-9942-81），ICOS抗体之二抗（GT ANTI-RAT，Ig G（H＋L）MSA KPL）（BIOT，Catalog No.16-16-12），SYBR Greener q PCR Master Mix（Invitr ogen公司），RNA提取试剂盒（Qiagen Mini RNA Easy Kit），SuperscriptTMⅢ 反转录 酶（Invitr ogen公司），和ABC复合物（武汉凌飞科技有限公司），q PCR引物由上海博道基因技术有限公司合成。冰冻切片机为德国Leica Micr osyste ms公司产品（型号CM1900），PCR仪为美国 MJ Research公 司 产 品 （型 号 PTC-200 Peltier Ther mal Cycler），实时定量PCR反应仪为美国Applied Biosyste m公司产品（型号PRISM 7500），显微镜（型号BX51）及数码相机（型号DXM1200配Nikon ACT-1软件）为日本Ol y mpus和Nikon公司产品。

3.免疫组织化学技术

小鼠断颈处死，立即取肾并在4%多聚甲醛液固定48 h，然后30%蔗糖-PBS浸泡24 h。冰冻切片（厚20μm）浸入含0.3%Triton X100的0.01 mol／L PBS破膜15 min，再用3%牛血清白蛋白于室温下封闭1 h。倾去封闭液，加入1∶1000稀释的一抗（ICOS抗体）于4℃孵育48 h，然后0.01 mol／L PBS漂洗3次。组织切片再滴加1∶1000稀释的二抗约30μl，室温孵育2 h，0.01 mol／L PBS漂洗3次。之后组织切片滴加ABC复合物30μl于室温孵育2 h，0.01 mol／L PBS漂洗3次。组织切片滴加DAB显色液30μl，显色15-20 min后用0.01 mol／L PBS漂洗3次。组织切片经脱水、透明及封片后，于光镜下观察，对细胞染色反应采用目测半定量法，即深棕黄色为强阳性，棕黄色为阳性，浅棕黄色为弱阳性，未染色为阴性。在封闭同时或者封闭之后用过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，没有经过苏木素复染。阴性对照组为不加一抗染色。

4.肾组织总RNA提取及c DNA合成

分别取8周龄正常C57BL／6雄性小鼠以及8、16周不同周龄BXSB雄性小鼠各6只，提取肾组织总RNA（total RNA）及c DNA的合成：本研究选用德国Qiagen公司生产的RNA提取试剂盒（Qiagen Mini RNA Easy Kit）。经提取纯化的总 RNA 先被反转录成为c DNA，这一步选用美国Invitrogen公司生产的SuperscriptTMⅢ反转录酶。反应组成如下：1μg的 RNA （容积约为3-5μl），10μl的反转录反应液（2×），2μl的Superscript反转录酶混合液，加水至20μl。反应在25℃10 min，50℃30 min，85℃5 min后在冰上冷却，再加入1μl E.coli RNase H酶，继续在37℃反应20 min。然后，把反转录的c DNA稀释为5ng／μl用于q PCR反应或者储藏于-20℃冰箱内待测。

5.定量实时多聚酶链式反应（q PCR）

待扩增的ICOS分子基因和1个内参照基因3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的引物全部用PRI MER3在线软件设计（http：／／frodo.wi.mit.edu／）。引物信息：ICOS前向引物GTGCAGCTTTCGTTGTGGTA，逆向引物TTAGGGTCATGCACACTGGA，Gen Bank＃ NM＿017480，GAPDH 前向引物GGCATTGCTCTCAATGACAA，逆向引物 ATGTAGGCCATGAGGTCCAC，Gen Bank＃ NM＿008084。待测基因序列自下列网站获取：http：／／www.geno me.ucsc.edu。待测基因ICOS和参照基因GAPDH的扩增产物均跨过两个外显子从而达到特异性地只扩增从mRNA反转录来的c DNA，但不会扩增任何来源的基因组DNA。反应组成如下：20ng的c DNA（4μl），10μM 的前向和逆向引物各0.2μl，2×浓缩反应液5μl（SYBR Greener q PCR Master Mix，Invitr ogen公司），加水至10μl。所有待测样品均设定3个重复反应，以求高精度的结果。本实验采用Applied Biosystem Inc公司的PRISM 7500型q PCR反应仪，反应程序如下：50℃2 min，95℃10 min之后，进行40个循环的反应：95℃15s，55℃30s，70℃30s。反应结束后，从机器程序中输出每个反应的临界循环数，即CT值，用于后续计算。

6.基因表达水平的测定

首先需要为每个基因的反应构建标准曲线。本实验从每个高质量的待测样品c DNA溶液中各抽取等分量，然后合并成一个标准样品，并且准确测定这个标准样品的c DNA浓度。根据测定的标准样品浓度，制备一个系列的稀释样品：100、50、20、10、5、2、1ng／μl。用这7个稀释度的样品分别为2个基因构建标准曲线。然后依据标准曲线计算每个基因在待测样品中的相对表达水平。最后，以正常小鼠的表达水平为基线，其它各组均被正常鼠的表达值校正。

7.统计学方法

实验数据处理应用SPSS13.0版统计分析软件，数据以¯x±s表示。根据方差齐性检验结果，两组间用独立样本t检验。以P≤0.05为统计学差异有显著性。

结 果

1.免疫组织化学染色结果

正常组小鼠肾组织染色结果：少许ICOS阳性细胞位于肾小管，呈浅棕色着色；（图1 A）；

8周龄BXSB小鼠肾组织染色结果：ICOS强阳性表达，细胞呈深棕色着色，位于肾小管，较平均分布（图1B）；

16周龄BXSB小鼠肾组织染色结果：ICOS强阳性表达，细胞呈深棕色着色，位于肾小管，较平均分布（图1C）。

图1 小鼠肾ICOS免疫组织化学染色：（A.正常对照组；B.8周龄BXSB小鼠；C.16周龄BXSB小鼠；）标尺＝100μmFig.1 Immunohistochemical staining of ICOS in the kidney of 16-week BXSB mice（A.control mice，B.8-week BXSB mice，C.16-week BXSB mice），Bar＝100μm

2.实时PCR定量结果

标准化后的肾组织ICOS mRNA表达水平在正常组鼠为4.58±0.63；8周龄BXSB小鼠为6.43±0.92；16周龄BXSB小鼠为9.48±1.30。两组间经t检验，结果显示8周龄和16周龄BXSB小鼠均显著高于正常对照组（P＜0.01）；同时16周龄BXSB小鼠亦显著高于8周龄BXSB小鼠（P＜0.05）（图2）。

图2 BXSB雄性小鼠肾ICOS mRNA表达水平Fig.2 mRNA expression level of ICOS in the kidney of BXSB male mice

讨 论

1999年德国学者Hutloff等在人外周血活化T细胞上发现了一种新的共刺激分子，命名为ICOS（inducible T-cell co-sti mulator，inducible co-sti mulator）［4］。ICOS为I型跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员。ICOS优势表达在活化的T细胞表面，表明ICOS对活化的T细胞的调节更为重要，但在受到炎性刺激时也可以表达于肺、肾、骨骼肌等非淋巴组织上［5］。鉴于活化的T细胞表达ICOS，而且ICOS及其配体途径调控T细胞应答的效应阶段，ICOS在自身免疫病中的作用受到广泛重视。对重症肌无力、溃疡性结肠炎、炎性肌病、类风湿性关节炎等自身免疫病的研究均证实ICOS及其配体途径与自身免疫病的发病存在密切关系［6、7］。

BXSB狼疮鼠为重组近交系小鼠，能自发地出现淋巴结肿大、T细胞功能障碍、多克隆B细胞过度活化、多种自身抗体的产生等表现，临床和病理表现与人类SLE极其相似，尤其是雄性BXSB小鼠，由于Y染色体上带有Yaa基因使其发病早且严重，一般从8周龄开始即发病，故常被作为SLE的小鼠动物模型，广泛用于实验研究中［8］。本研究用免疫组织化学及实时定量PCR方法，探索ICOS在BXSB小鼠LN中的作用机制。

本研究结果显示：正常组鼠肾组织ICOS免疫组织化学染色结果未见明显染色，但是实时PCR定量检测其仍有ICOS表达。不同周龄BXSB小鼠肾组织均有ICOS阳性染色，阳性细胞位于肾小管，而PCR定量检测亦显示ICOS表达较正常组鼠肾组织有明显增加。我们的研究结果提示ICOS在BXSB小鼠肾脏有随周龄表达增加的趋势。笔者推测ICOS表达于肾小管上皮细胞可能与肾小管在一定程度上参与抗原呈递有关，提示BXSB小鼠肾损害的发病、疾病的活动可能与肾内ICOS分布与表达的的共刺激信号强度增加有关。

关于ICOS与LN的关系尚少见文献报道。Iwai H［9］在SLE动物模型 NZB／NZW Fl代雌性小鼠中检测到脾脏和外周血T淋巴细胞膜表面ICOS表增高。Patschan S［10］基于对28例系统性红斑狼疮患者的临床研究，认为CD4＋T细胞上ICOS的表达与狼疮肾损害和疾病活动度密切相关。以上研究均未涉及ICOS在BXSB小鼠肾内分布的可能影响。进一步探讨ICOS及其配体通路在LN中的精确作用，研究多种共刺激分子间如何协同调节免疫应答，对明确LN的发病机制，寻求新的治疗方法，有着重要的意义。

［1］Ortega L M，Schultz DR，Lenz O，et al.Review：Lupus nephritis：pathologic features，epidemiology and a guide to therapeutic decisions Lupus，2010，19（5）：557-574

［2］Si mpson TR，Quezada SA，Allison JP.Regulation of CD4 T cell activation and effector f unction by inducible costi mulator （ICOS）.Curr Opin Immunol，2010 ，22（3）：326-332

［3］Gizinski AM，Fox DA，Sarkar S.Phar macotherapy：concepts of pathogenesis and e mer ging treat ments.Costi mulation and T cells as therapeutic targets.Best Pract Res Clin Rheu matol.2010 ，24（4）：463-477

［4］Hutloff A，Dittrich AM，Beier KC，et al.ICOS is an inducible T-cell costi mulator str ucturally and f unctionally related to CD28.Nat ure，1999，397（6716）：263-266

［5］Loke P，Allison JP.Emerging mechanis ms of i mmune regulation：the extended B7 fa mily and regulatory T cells.Arthritis Res Ther，2004，6（5）：208-214

［6］Shar pe AH.Mechanis ms of costi mulation.I mmunol Rev.2009 May；229（1）：5-11

［7］Dalakas MC.Infla mmatory disor ders of muscle：pr ogress in poly myositis，der mato myositis and inclusion body myositis.Curr Opin Neur ol.2004 Oct；17（5）：561-567

［8］Grande JP.Experi mental models of lupus nephritis.Contrib Nephrol.2011；169：183-97.Epub 2011 Jan 20

［9］Iwai H，Abe M，Hirose S，et al.Involvement of inducible costi mulator-B7 ho mologous protein costi mulator y path way in murine lupus nephritis.J Immunol.2003 Sep 15；171（6）：2848-2854

［10］Patschan S，Dolff S，Kribben A，et al.CD134 expression on CD4＋ T cells is associated with nephritis and disease activity in patients with systemic lupus er yt hematosus.Clin Exp Immunol.2006，145（2）：235-242

Expression of Inducible Costi mulator in Kidney of BXSB Mice

Wang Wei wei，Huang Anbin，Du Rong，Liu Yuhong，Song You，Shen Lingxun，Yu Likai＊
（Depart ment of Rheu matology，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China）

Objective By anal ysis of t he expression of inducible costi mulator（ICOS）in t he kidney of BXSB mice，this study was trying to clarify the potential role of ICOS in the pathogenesis of lupus nephritis in BXSB mice.Met hods ICOS was detected in contr ol mice，8-week and 16-week BXSB male mice by using i mmunohistoche mistry and real-ti me PCR.Results ICOS i mmunostaining in contr ol mice was light brown and distributed in few renal tubules；but in 8-and 16-week BXSB mice，the ICOS i mmunostaining was much str onger as dar k br own t han that in contr ol mice.The mRNA expression of ICOS was significantly increased in renal tissues fro m 8-and 16-week BXSB mice as co mpared with that in the control mice（6.43±0.92 and 9.48±1.30 vs 4.58±0.63，P＜0.01），and f urt her more，t here was significantl y difference in ICOS mRNA expression bet ween 8-and 16-week BXSB mice（P＜0.05）.Concl usion Distribution and up regulation of ICOS may constitute a mechanis m that was involved in the pathogenesis of lupus nephritis in BXSB mice.

Inducible costi mulator；Lupus nephritis；I mmunohistochemistry；BXSB mouse

R334＋.1

A

10.3870／zgzzhx.2012.04.012

2012-02-20

2012-05-25

王玮炜，女（1982年），汉族，博士研究生。

＊通讯作者（To who m correspondence should be addressed）