血管生成拟态和E-cad在食管鳞状细胞癌中的表达及临床意义

宋文庆 俞 岚 武世伍 周 蕾 承泽农

血管生成拟态和E-cad在食管鳞状细胞癌中的表达及临床意义

宋文庆 俞 岚 武世伍 周 蕾 承泽农

（蚌埠医学院第一附属医院病理科，蚌埠医学院病理学教研室，安徽省感染与免疫重点实验室；安徽233030）

目的 探讨血管生成拟态 （vasculogenic mi micry，V M）与E-钙粘蛋白（E-cadherin，E-cad））在食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma）组织中的表达及意义。方法 收集食管鳞状细胞癌术后标本100例和30例癌旁正常食管黏膜，应用免疫组化法和组织化学法检测食管鳞状细胞癌和正常食管黏膜组织中VM和E-cad的表达情况。结果 在食管鳞状细胞癌组织和正常食管黏膜组织中，VM和E-cad的阳性表达率分别为47.0%、48.0%和0%、70.0%，差异有统计学意义（P＜0.05）；VM及E-cad的表达与食管鳞癌的组织学分级、临床分期及淋巴结转移（P＜0.05）；VM与E-cad在食管鳞癌中的表达呈负相关（r＝-0.865，P＝0.000）。多因素分析：PTNM分期、淋巴结转移、V M和E-cad的表达是影响食管鳞癌根治术后患者预后的独立因素（P＜0.05）；V M 阳性组与阴性组的5年生存率分别为4.3%和64.2%，，差异有统计学意义（P＝0.000）；E-cad阳性组与阴性组5年生存率分别为60.4%和15.4%，差异有统计学意义（P＝0.000）。结论 具有V M结构的食管鳞状细胞癌的分化程度低，恶性度高，预后差，V M和E-cad表达的程度与食管鳞状细胞癌的进展和预后密切相关。

食管鳞状细胞癌；血管生成拟态；E-钙粘蛋白；预后

肿瘤血管生成拟态（vasculogenic mi micry，V M）是近年来发现的存在于恶性肿瘤的特殊的血供方式。是肿瘤细胞为了满足自身的血液供应，在没有内皮细胞的参与下，通过自身表型和细胞外基质重塑而围成的一种类似血管样的管道，是一种不依赖血管内皮细胞的肿瘤微循环模式。肿瘤组织通过V M这种新的血液供应方式可与宿主血管连通获取营养，使得肿瘤很容易侵袭和转移，增加了肿瘤的恶性程度。V M结构中癌细胞之间、癌细胞与基质之间的黏附机制，通过细胞黏附分子（cell ular adhesion mo lecule，CA M）发挥关键性作用。其中钙黏蛋白（E-cadherin，E-cad）家族是CA M 中的重要成员，其结构功能介导着正常和肿瘤组织中细胞-细胞间的黏附，其表达程度的变化与肿瘤的生物学行为直接相关，影响着肿瘤细胞的脱离与再黏附。食管癌分为鳞癌和腺癌，其中鳞癌最多，大约占95%左右。其发生率和死亡率比较高。本研究通过对100例食管鳞状细胞癌根治性手术病例标本V M及E-cad水平的检测，探讨其表达与食管鳞癌侵袭、转移以及预后的关系。

材料和方法

1.标本来源

标本来自蚌埠医学院第一附属医院2005年1月-2006年6月食管癌手术患者100例（术前未行放，化疗），癌旁正常食管黏膜30例。所有病例均有完整的临床病理及随访资料。入选病例随访至患者死亡或截止2011年2月。随访时间为5-56个月。按分化程度分为：高分化26例，中分化52例，低分化22例。按淋巴结有无转移，有转移41例，没有转移59例。肿瘤的最大平均直径3.0c m，＞3.0c m 55例，≤3.0c m 45例。根据UICC2002版PTNM病理分期标准进行分期，其中Ⅰ期患者23例，Ⅱ期患者32例，Ⅲ期患者34例，Ⅳ期患者11例。复阅上述患者的病理切片，经两位有经验的病理医师复检。所有标本经10%甲醛固定，常规脱水包埋，制成4μm厚连续石蜡切片。对照组正常食管黏膜30例，取自肿块＞5.0c m处，病理HE染色证实为正常食管黏膜。

2.试剂

鼠抗人CD34单克隆抗体（克隆号QBEnd／10）及鼠抗人E-cad单克隆抗体（克隆号：MM（36B5）），Elivision T M pl us试剂盒及DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司。PAS染色液为蚌埠医学院第一附属医院病理科配制。

3.实验方法

3.1 采用免疫组织化学Elivision T M pl us法，将石蜡标本以4μm厚连续切片，烤干，于二甲苯溶液及不同浓度的乙醇中脱蜡至水洗。免疫组化染色操作步骤按试剂盒说明书进行。采用已知阳性片作对照，以PBS液代替一抗作空白对照。

3.2 CD34和PAS套染

CD34染色，DAB显色后，水流冲洗1 min终止显色反应，将切片置于0.5%高碘酸溶液中氧化10 min。流水冲洗2 min后置于Schiff液中染色15-30 min，然后蒸馏水冲洗3次，每次1 min，蒸馏水冲洗3-5 min；此后依次苏木素浅染细胞核、盐酸酒精分化、返蓝、脱水透明以及中性树胶封片。

3.3 微血管密度（MVD）计数

CD34主要表达在血管内皮细胞的细胞浆和胞膜，从而可以通过CD34的阳性表达来进行MVD计数，参照修改过的Weidner［1］法来计数。

4.结果判断

CD34和E-cad均以细胞膜和细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性。采取二次计分法：每例标本随机计数5个高倍视野（×400），计数每个高倍视野中阳性细胞所占百分比并计分。首先将染色强度计分：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。再将阳性细胞百分比计分，0分为阴性，1分为阳性细胞为＜10%，2分为11%-50%，3分为51%-75%，4分为＞75%。用染色强度得分和细胞数得分的乘积作为判断表达结果，若积分≤2为阴性，＞2为阳性。免疫组化结果由高年资病理医师读片评定。

5.统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。V M和E-cad表达阳性组与阴性组生存分析用Kaplan-Meier法，组间比较用l og-rank检验，多因素分析采用Cox回归多因素模型，V M和E-cad在食管癌组织中表达与正常食管黏膜组织、各临床及病理因素的相关性采用Fisher exact法检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.食管癌中存在V M（见图1）

食管癌组织中可检测到V M的存在，在HE染色切片中查见由肿瘤细胞围绕形成的管腔样结构，腔内可见红细胞（见图1）；通过CD34和PAS套染，V M表现为PAS染色阳性但CD34阴性的管腔样结构，具有V M的肿瘤细胞附近没有坏死的肿瘤细胞（见图2）。E-cad主要表达于食管癌细胞浆，呈棕黄色（见图3），但是有V M存在的食管组织中E-cad多为阴性表达（见图4）。食管癌组及正常食管黏膜组中V M检测阳性率分别为47%（47／100）及0%（0／30），E-cad蛋白阳性表达率分别为 48% （48／100）及70.0%（21／30），两组差异均具有统计学意义（P＜0.05）（见表1）。

表1 食管癌及正常食管黏膜组织中V M及E-cad蛋白的表达Table 1 Expression of V M and E-cad in esophageal cancer and Nor mal esophageal mucosa

2.食管鳞状细胞癌中V M及E-cad的表达与临床病理参数的关系

V M及E-cad阳性表达率与患者的年龄、性别、肿瘤的大小之间差异均无统计学意义（P＞0.05）。肿瘤分化程度越低，V M的表达越强，差异有显著性（P＜0.05），PTNM 分期Ⅰ-Ⅱ期 V M 阳性率为7.27%（4／55），Ⅲ-Ⅳ 期 V M 阳 性 率 为 95.6%（43／45），V M组的PTNM分期与无V M组的PTNM分期相比差异有统计学意义（P＜0.05），且V M组的患者更易发生淋巴结转移（P＜0.05）（见表2）。肿瘤的分化程度越高，E-cad的表达越强；分化程度越低及伴有淋巴结转移的病例中E-cad的表达降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。Ⅰ-Ⅱ期肿瘤中E-cad的阳性率为83.6%（46／55），Ⅲ-Ⅳ期肿瘤中E-cad的阳性率为4.44%（2／45），两者之间差异具有统计学意义（P＜0.05）（见表2）。

表2 100例食管鳞状细胞癌组织中V M和E-cad的表达与临床病理因素的关系Table 2 Correlation of V M and E-cad expression to clinicopathologic characteristics of 100 patients wit h esophageal cancer

3.食管癌中V M与E-cad表达的关系

Spear man相关分析显示，在食管鳞癌中VM与E-cad的表达呈负相关（r＝-0.865，P＝0.000）（见表3）。

表3 食管癌中V M与E-cad表达之间的关系Table 3 Correlation of V M expression to E-cad expression in esophageal cancer

4.多因素分析

将病理组织分化（分为高分化组、中分化组与低分化组），年龄（分为≤60岁组与＞60岁组）、PTNM分期（分为ⅠⅡ期组与ⅢⅣ期组）、肿瘤直径（分为≤3.0c m组与＞3.0c m组）、淋巴结转移（分为有转移组与无转移组）、性别（男性组与女性组）、VM（分为表达阳性组与阴性组）和E-cad（分为表达阳性组与阴性组）等因素引入Cox模型进行多因素分析，结果显示：VM和E-cad的表达及PTNM分期和淋巴结转移是影响食管鳞状细胞癌根治术后患者预后的独立因素（见表4）。

表4 100例食管鳞状细胞癌患者多因素分析Table 4 Multivariate survival analysis of 100 patients with esophageal cancer

5.生存分析

本组病例总的5年生存率为36.0%。Kaplan-Meier生存分析显示VM阳性组与阴性组5年生存率分别为4.3%和64.2%，差异有统计学意义（P＝0.000）；E-cad阳性组与阴性组5年生存率分别为60.4%和15.4%，差异有统计学意义（P＝0.000），生存曲线见图5、图6。

讨 论

食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，我国是世界上食管癌发病率和死亡率最高的国家之一。晚期食管癌的重要死因是浸润和转移。肿瘤的生长和转移与新生血管的形成密切相关。既往观点认为，内皮细胞依赖性血管是肿瘤循环的唯一形式。但是，Maniotis［2］等发现在高侵袭性黑色素瘤中，存在一种高碘酸-希夫染色阳性，CD34阴性的管网状结构。并将其称为VM，推测其参与了肿瘤的微循环。随后在卵巢癌、炎性乳腺癌、肝细胞癌、胆囊癌、肺癌等一些恶性肿瘤中证实了血管生成拟态的存在［3-7］。且有研究表明，侵袭性肿瘤的转移和预后不良与VM的存在密切相关［8］。VM常位于肿瘤细胞巢内部，是由肿瘤细胞通过自身变形围成，没有血管内皮细胞参与、由细胞外基质界定的微循环管道。这些结构可以是实芯也可以是中空。VM的管壁PAS染色阳性，但CD34等内皮细胞标志物的染色阴性，进一步提示VM中不含有内皮细胞。

血管生成拟态现象在肿瘤生物学中可能具有十分重要的意义。一方面，由血管生成拟态方式形成的管腔没有内皮细胞的屏障作用，从理论上讲可以为肿瘤的生长提供更好的灌注。将炎性乳腺癌细胞株WIBC体内移植后，形成的肿瘤组织中血管很少，但是肿瘤中心区域的细胞却很少发生坏死，推测可能是由于血管生成拟态现象的存在为肿瘤的生长提供了足够的血液和氧气供应［9-10］。另一方面，血管生成拟态的发生需要破坏组织形成管道，加上没有了内皮细胞的屏障作用，管壁外衬的肿瘤细胞在释放蛋白水解酶并溶解基底膜后就可以直接进入血流，因此更有利于肿瘤的侵袭和转移。Shirakawa等［11］对331例手术切除的乳腺癌标本进行了研究，结果发现存在V M的病例比无V M的病例有更高的血源转移和更低的5年生存率。Folberg［12］认为，V M的结构由于缺乏内皮细胞衬覆，管壁上的肿瘤细胞容易脱落进入管道中，进而进入血管并向远处转移，因此与肿瘤的转移及不良预后密切相关。

本实验采取免疫组化和特殊组织化学双重染色技术，对100例食管鳞癌组织进行检测，在47例中发现了符合V M标准的管道结构，证实了在食管鳞癌中确实有V M的存在。同时发现表达VM的区域很少出现坏死，证实V M是一种功能性微循环。且通过分析发现V M的表达与肿瘤细胞的分化程度、临床分期、淋巴结转移等具有相关性（P＝0.000），V M阳性组肿瘤分化程度差、临床分期晚、淋巴结转移率高。这与国内外文献报道基本一致［13-14］。

钙粘蛋白（cadherin）是一组钙依赖性跨膜糖蛋白，上皮细胞钙粘蛋白（E-cadherin，E-cad）是其家族中的主要成员，其广泛分布于上皮组织中，是基因CDH1编码的一类介导细胞-细胞间相互粘附、具有维持组织结构完整性和极性的钙离子依赖性跨膜糖蛋白。E-cad的前体是135 KD的多肽，合成后，很快在高尔基体上加入碳水化合物，成为成熟的多肽，并被释放到细胞表面，迅速定位于细胞接触，介导相邻细胞间的同种连接。主要分布于同种上皮细胞侧面的粘附小带处，对极化上皮细胞之间的粘附起主要作用［15］。E-cad异常表达是分子离散的基础，当E-cad表达下调或功能障碍时，细胞间的黏附能力就会下降，肿瘤细胞就会彼此松动、分离，进而自原发灶脱落，逐步向深层浸润、并向局部淋巴结及远处转移［16］。因此，E-cad表达下降与肿瘤的侵袭和进展密切相关。

实验结果显示E-cad的表达与肿瘤细胞的分化程度、临床分期、淋巴结转移等具有相关性（P＝0.000），而且E-cad的表达越低，肿瘤细胞的分化程度降低、临床分期越晚，更容易发生转移。并且，本研究发现，随着E-cad的表达率的降低，VM的表达率显著升高，两者呈现负相关性（r＝-0.865，P＝0.000）。这一结果提示在VM形成过程中，E-cad可能起到某种关键性的作用。E-cad表达的减少，不仅使细胞间附着变得松散，也使得细胞内的骨架由于缺少相邻细胞间的黏附而形成的固定作用，获得了自身变形并形成细胞间腔隙的能力，促进VM的形成。

本研究多因素分析显示，VM和E-cad的表达、PTNM分期以及淋巴结转移是影响食管鳞癌患者的独立预后因素。进一步的生存分析显示，VM阳性组与阴性组的5年生存率分别为4.3%和64.2%，差异有统计学意义（P＜0.05），提示VM阳性组5年生存率比VM阴性组更低，这与文献报道结果相同［17］；E-cad阳性组与阴性组的5年生存率分别为58.3%和13.5%，差异有统计学意义（P＜0.05）。提示E-cad的表达对肿瘤患者的生存率及生存期预后的估计可能有一定的指导意义。

VM的发现，改变了人们对肿瘤血供的传统观念，使人们对肿瘤细胞的一些特殊生物学性状有了新的认识，亦为肿瘤的治疗提供了一种极具潜在应用价值的新思路、新途径。本实验结果提示，具有VM的食管鳞癌恶性程度更高，预后更差，E-cad在VM形成过程中起着重要的作用。目前，关于VM的研究尚处于初步阶段，还有很多的机制和现象尚需要进一步探索，是否所有的低分化高侵袭性肿瘤中都存在VM？VM的形成还和哪些因素有关？随着对VM形成机制更加深入地研究，必将对食管癌的治疗提供新的有效途径。

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图 版 说 明

V M和E-cad在食管鳞癌中的表达

图1 食管鳞状细胞癌中的VM（黑色箭头所指的是V M，HE×400）

图2 VM在食管鳞状细胞癌中的阳性表达（黑色箭头所指的是V M，红色箭头所指的是毛细血管，×400）

图3 E-cad在食管鳞状细胞癌中的阳性表达（Elivision T M×400）

图4 E-cad在含有V M结构的食管鳞状细胞癌中的阳性表达（Elivision T M×400）

图5 V M表达阳性组与阴性组食管鳞癌生存曲线

图6 E-cad表达阳性组与阴性组食管鳞癌患者生存曲线carcino ma

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 VM in esophageal squamous cell carcino ma（black arrow is V M，HE×400）

Fig.2 Positive staining of VM in esophageal squamous cell carcino ma（black arr ow is V M，red arrow is capillary，×400）

Fig.3 Positive staining of E-cad in plas ma of esophageal squamous cell carcino ma（Elivision T M，×400）

Fig.4 Negative staining of E-cad in esophageal squamous cell carcino ma（Elivision T M，×400）

Fig.5 Survival curves of squamous cell carcino ma patient with positive or negative V M expression.

Fig.6 Survival curves of squamous cell carcino ma patients with positive or negative E-cad expression

Expression of V M and E-cad in esophageal squamous cell

Expression and significance of vasculogenic mi micry and E-cad in esophageal squamous cell carcinoma

Song Wenqing，Yu Lan，Wu Shi wu，Zhou Lei，Cheng Zenong＊
（Depart ment of Pathology，The first Affiliated Hospital of Bengbu Medical Coll ge，Bengbu Medical College，Anhui Key Labor ator y of Infection and I m munol ogy，Anhui 233030，China）

Objective To explore whether vasculogenic mi micry（V M）exists in esophageal squa mous cell cancer or not and to el ucidate t he relationship bet ween t he expression of E-cad and V M.Met hods The expression of E-cad and V M in 100 speci mens of esophageal squa mous cell carcino ma and 30 speci mens of nor mal mucosa were detected by i mmunohistochemical and histochemical staining.Results The positive rates of V M and E-cad pr otein in esophageal squa mous cell carcino ma were 47.0%and 48.0%，respectively，the positive rates of V M and E-cad protein in speci mens of nor mal mucosa were 0%and 70.0%，and t here was a significant diff erence bet ween the t wo（P＜0.05）.Expression of V M and E-cad in esophageal squa mous cell carcino ma was significantly related to differentiation、PTNM stage and ly mphnode metastasis（P＜ 0.05）.There was a negative relationship bet ween the expression of E-cad and VM （r＝-0.865，P＝0.000）.PTNM stage、l y mphnode metastasis and expression of V M and E-cad were independent prognosis factors of esophageal squa mous cell carcino ma（P＜0.05）.The five-year survival rate of the V M-positive and V M-negative gr oup was significantl y diff erent（4.3%vs 64.2%），while t he five-year sur vival rate was significantly higher in t he E-cad-negative gr oup t han in E-cad-positive gr oup（15.4%vs 60.4%）.Conclusion Esophageal squamous cell carcino ma with V M had a poor differentiation and a bad clinical prognosis；the level of V M and E-cad is correlated to pr ogression and pr ognosis of esophageal squa mous cell carcino ma.

Esophageal squamous cell carcino ma；V M；E-cad；Prognosis

R735.1

A

10.3870／zgzzhx.2012.04.021

2012-03-03

2012-06-10

宋文庆，女（1971年），汉族，讲师。