ERK1／2在高温致神经管畸形神经上皮细胞中的表达变化

张淑娟 张天亮 王 力 李锋杰 于 丽 刘长云

ERK1／2在高温致神经管畸形神经上皮细胞中的表达变化

张淑娟 张天亮 王 力 李锋杰 于 丽＊刘长云＊

（潍坊医学院组织学与胚胎学教研室 山东261053）

目的 探讨高温致神经管畸形（NTDs）作用的分子机制，为防治NTDs的发生提供理论依据。方法 在高温致金黄地鼠NTDs模型的基础上，应用免疫荧光染色技术，观察NTDs发生过程中p-ERK1／2在鼠胚神经上皮细胞中的表达变化。结果 对照组和实验组孕鼠在高温水浴处理后16、24h，p-ERK1／2免疫阳性产物分布于鼠胚神经上皮细胞和周围间充质细胞的胞浆中；水浴后36、60h，p-ERK1／2表达部位出现了由细胞浆向细胞核的转移；高温处理后，p-ERK1／2在实验组各期胚胎神经上皮细胞内的表达均比对照组减弱。结论 ERK1／2参与胚胎神经管的发育过程，其表达降低在高温致神经管畸形的发生中起重要作用。

细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）；神经管畸形；高温；金黄地鼠

神经管畸形（neural t ube def ects，NTDs）是由于神经管的发生和分化紊乱而引起的一系列中枢神经系统的发育异常，是人类出生缺陷中最严重最常见的一组畸形，包括无脑儿、脊柱裂、脑积水、脑膨出等多种临床表型。流行病学调查［1］显示，NTDs的发生率为1‰-3‰，我国每年约有10万左右的NTDs患儿出生。NTDs是一组受多因素影响、涉及多个基因的复杂畸形，是遗传因素与环境因素共同作用的结果［2］，高温是NTDs最为常见的物理致畸因子，胚胎组织在发育过程中受到高温损伤后，细胞的正常增殖、分化和迁移过程受阻，从而导致器官畸形的发生，但高温致NTDs发生的具体分子机制尚不明确［3，4］。本实验在高温致 NTDs模型上，通过免疫荧光染色技术观察p-ERK1／2在NTDs发生过程中胎鼠神经上皮细胞中的表达变化，探讨ERK1／2与神经管发育及高温致畸发生之间的关系，为防治NTDs的发生提供理论依据。

材料和方法

1.实验动物及标本制备

成年未经产雌性金黄地鼠50只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体重（100±10）g，常规鼠饲料喂养，于晚7-9时与雄鼠1∶1合笼，次日查有精子者定为孕第1天（E1）。将孕鼠随机分为对照组和实验组，实验组于E8下午3-4时，置42℃水浴20 min，制备高温致NTDs动物模型；对照组置37℃水浴20 min。分别于水浴后16、24、36、60h（相当于胚龄第8.5、9、9.5、10.5d）将孕鼠处死，剖腹取鼠胚，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，连续切片，厚5μm，裱片后备染。

2.免疫荧光染色

切片常规脱蜡入水，0.01 mol／L枸橼酸盐缓冲液（p H 6.0）微波抗原修复，冷却后用0.01 mol／L PBS冲洗；滴加正常山羊血清，37℃孵育30 min；滴加鼠抗p-ERK1／2（1∶100，Santa），4℃冰箱过夜；滴加Cy3标记的羊抗鼠Ig G（1∶600，Sig ma），避光条件下37℃孵育50 min；滴加DAPI，37℃避光孵育30 min，0.01 mol／L PBS冲洗；以防淬灭封片剂封片，4℃冰箱避光保存；荧光显微镜观察、拍照。用PBS代替一抗作为阴性对照。

3.统计学处理

每组取切片10张，经正置荧光显微镜（LEICA DM1000）观察拍片，将所得图片在IPP6.0图像分析软件中进行图像分析，经剪除背景，屏分割和选删除后，测量各组阳性表达细胞的平均光密度（OD值），用SPSS16.0统计软件进行分析。将实验组和对照组相应部位的OD值（平均光密度±标准差）作t检验分析。在统计结果中，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

在金黄地鼠胚胎发育各阶段的神经上皮细胞中，p-ERK1／2的表达呈现规律性变化。对照组各期胚胎神经上皮细胞和周围间充质细胞内均检测到p-ERK1／2的表达，水浴后16、24 h，p-ERK1／2免疫阳性产物均分布于鼠胚神经上皮细胞和周围间充质细胞的细胞浆中，水浴后36、60h，p-ERK1／2表达部位出现了由细胞浆向细胞核的转移，水浴后36h，p-ERK1／2分布于鼠胚神经上皮细胞细胞浆和边缘层细胞的细胞核中；水浴后60h，p-ERK1／2分布在神经管顶板、神经管背侧及背外侧的神经细胞的细胞核，腹侧阳性细胞较少（图2）。

p-ERK1／2在实验组各期胚胎神经上皮细胞中的分布与对照组相似，高温后16、24、36h，p-ERK1／2在实验组胚胎神经上皮细胞中的表达较对照组均有不同程度减弱，尤以16h差异最为显著（P＜0.01），水浴后60h实验组与对照组相比p-ERK1／2表达差异无显著性（图1）。

图1 p-ERK1／2在高温致神经管畸形胚胎神经上皮细胞中的表达（＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）Fig.1 The expression of p-ERK1／2 protein in the ha mster embryonic neuroepithelial cells of NTDs induced hyperther mia（＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）

讨 论

神经管畸形是由于神经管胚胎发生各时期闭合不良所致的一组先天性疾病，神经管的发生和分化是神经上皮在脊索及其周围间充质的诱导下细胞增殖分化和细胞形态变化的结果。在神经管分化发育过程中，需众多调节因子参与，多种信号通路构成复杂的调控网络，涉及一系列相关基因的开放和表达，所有能阻碍和干扰正常发育过程的因素，包括遗传因素及环境因素都可能影响神经管的闭合，从而导致NTDs的发生。

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）为一组广泛存在于细胞内的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶超家族，其介导的信号途径可调控基因表达和促有丝分裂，参与调控增殖、分化、凋亡等细胞活动［5］，是细胞应激和损伤反应的主要信号通路［6，7］。细胞外信号调节蛋白激酶（extracell ular signal regulated kinases，ERKs）为其家族的重要成员，包括 ERK1～ERK8［8］。ERK主要分布于胞浆中，在所有真核细胞中普遍表达，被其上游特异性激酶 MEK活化后的ERK（p-ERK）可转位至细胞核，促进多种转录因子（如CREB）磷酸化，增强其转录活性影响蛋白质合成，起到将胞外刺激信号传到核内的介导作用，在机体许多生理、病理过程中如凋亡、细胞生长分化等均发挥重要的作用［9］。近年来研究发现，MAPKs广泛存在于各种动物的胚胎组织中，是参与细胞增殖和细胞凋亡的重要通路［10］。Roberts 等［11］提 出 在 胚 胎 发 育 过 程 中MAPKs信号转导机制及其相关基因表达调控密切相关。本实验通过免疫荧光染色观察到金黄地鼠胚胎神经管上皮细胞中，p-ERK1／2广泛表达于对照组，并产生了由细胞浆向细胞核异位的现象。这一结果提示，在胚胎早期神经管发育过程中，活化的ERK进入细胞核，激活转录因子，起到调控细胞生长、增殖和凋亡的作用。

马向东等［12］研究表明p-ERK1／2活性在糖尿病诱发的神经管缺陷组活性低于正常对照组活性。本实验高温处理后神经管上皮细胞中p-ERK1／2阳性表达降低。最近的许多研究表明，ERK具有神经保护作用。ERK的激活可促进SCN2.2细胞抗谷氨酸毒性损害［13］。同时ERK介导周围神经系统的发育［14］。另外ERK的激活还被证明与神经生长因子（NGF）、脑源性神经生长因子（BDNF）等神经营养因子的表达上调有关［15］。由此我们推测，在高温致畸形过程中，神经管中各种神经营养因子及其受体的减少或移位，使得ERK1／2表达下调，导致胚胎神经管细胞增殖减少、凋亡增加，从而影响神经管的正常发育。本实验结果初步证实ERK1／2参与胚胎神经管的发育过程，其表达降低在高温致神经管畸形的发生中起重要作用，对阐明高温致NTDs发生的分子机制，探讨有效的预防和治疗提供依据。

［1］Kondo A，Ka mihira O，Ozawa H.Neural tube defects：prevalence，etiology and prevention.Int J Urol，2009，16（1）：49-57

［2］Pad manabhan R.Etiology，pat hogenesis and prevention of neural tube defects.Congentit Ano m，2006，46（2）：55-67

［3］Qing Y，Ying mao G，Shaoling L.Identification and validation of differentially expressed genes in neural tube defects of golden hamster induced by hyperther mia using suppression subtractive hybridization.Int J Neurol Sci，2007，117（8）：1193-1208

［4］Qing Y，Ying mao G，Lujun B，et al.Role of Np m1 in proliferation，apoptosis and differentiation of neural ste m cells.Int J Neurol Sci，2008，266（1-20）：131-137

［5］M Krishna，H Narang.The co mplexity of mitogen-activated protein kinases（MAPKs）made si mple.Cellular and Molecular Life Sciences，2008，65（22）：3525-3544

［6］Ra man M，Chen W，Cobb MH.Differential regulation and Properties of MAPKs.Oncogene，2007，26 （22）：3100-3112

［7］Coreclle E，Djerbi N，Mari M，et al.Control of the Autophagy Maturationt Step by the MAPK ERK and p38.Autophagy，2007，3（1）：57-59

［8］Bogoyevitch M A，Court N W.Counting on mitogen-activated protein kinases-ERK 3，4，5，6，7 and 8.Cell Signal，2004，16：1345-1354

［9］Wang H，Dai Y，Fukuoka T，et al.Enhancement of sti mulation-induced ERK activation in the spinal dorsal horn and gracile nucleus neur ons in rats with peripherla nerve injur y.Eur J Neur osci，2004，19：884-890

［10］Owens DM，Keyse SM.Differential regulation of MAP kinase signaling by dual-specificity protein phosphatases.Oncogene，2007，26（22）：3203-3213

［11］Roberts PJ，Der CJ.Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treat ment of cancer.Oncogene，2007，26（22）：3291-3310

［12］马向东，陈必良，辛晓燕等.妊娠合并糖尿病诱发胚胎先天性神经管缺陷的MAPK激酶及细胞凋亡信号传导机制.现代妇产科进展，2003，12（5）：324-335

［13］Kar markar SW，Bottu m KM，Krager SL，et al.ERK／MAPK is essential f or endogenous neuropr otection in SCN2.2 cells.PloS One，2011，6（8）：e23493

［14］Newber n JM，Li X，Shoemaker SE，et al.Specific f unctions f or ERK／MAPK signaling during PNS develop ment.Neuron，2011，69（1）：91-105

［15］Célia D Cr uz，Francisco Cr uz.The ERK 1 and 2 Pathway in the Nervous System：Fro m Basic Aspects to Possible Clinical Applications in Pain and Visceral Dysf unction.Curr Neurophar macol，2007，5（4）：244-252

图 版 说 明

图2 免疫荧光染色示各时间点p-ERK1／2在胚胎神经上皮细胞中的表达。Bar＝50μm.A：对照组16h；B：高温组16h；C：对照组24h；D：高温组24h；E对照组36h：F：高温组36h；G：对照组60h；H：高温组60h

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.2 p-ERK1／2 i mmunofluorescent staining of embryonic neuroepit helial cells in different ti me.Bar＝50μm.A：control groups 16h；B：experi mental group 16h；C：control gr oups 24h；D：experi mental group 24h；E：control groups 36h；F：experi mental group 36h；G：control gr oups 60h；H：experi mental group 60h

Expression changes of ERK1／2 in the neuroepithelial cells of neural tube defects induced by hyperther mia

Zhang Shujuan，Zhang Tianliang，Wang Li，Li Fengjie，Yu Li＊，Liu Changyun＊
（Depart ment of Histology and Embr yol ogy，Weif ang Medical College，261053，China）

Objective To explore the molecular mechanism of neural tube defects（NTDs）induced by hyperther mia，which may provide a theoretical basis for the prevention of human NTDs.Methods On the base of establishing t he hypert her mia-induced gol den-ha mster NTD model，t he expression of ERK1／2 in t he neur oepit helial cells during t he occurrence of NTDs was detected using i mmunofl uorescent staining technique.Results In t he contr ol and experi mental gr oups，p-ERK1／2 i mmunoreactivity was diff usely distributed in the cytoplas m of neuroepithelial cells and mesenchy mal cells surrounding the neural tube at 16 and 24 hours after water bath treat ment.At 36 and 60 hours，the expressional site of p-ERK1／2 emerged from the cytoplasm to the nucleus.After maternal hyperther mia，the staining intensity of p-ERK1／2 i mmunoreactivity in the neuroepithelia of each experi mental group was weaker than that of the control group.Concl usion ERK1／2 is related to the devel op ment of t he neural t ube，and t he decreased expression of ERK1／2 may play an i mportant r ole in hypert her mia-induced NTDs.

Extracellular signal regulated kinase（ERK）；Neural tube defect；Hyperther mia；Gol den ha mster

R321.58

A

10.3870／zgzzhx.2012.04.002

2012-03-12

2012-05-25

国家自然科学基金资助（30900775），山东省自然科学基金资助（ZR2010CQ036）

张淑娟，女（1986年），汉族，硕士研究生。

＊通讯作者（To who m correspondence should be addressed）