PARP－1基因多态性与临夏回族自治州回族人群胃癌易感性的关联研究

唐小凡 何正德 李玉民 蒋祥林

幽门螺旋杆菌 (H．pylori)感染、盐腌食品、饮酒、吸烟等是与胃癌发生有关的主要危险因素。然而，接触同样的危险因素，却仅有部分人发生胃癌，说明不同个体对胃癌的易感性存在差异，其遗传学基础是人类基因组DNA序列的变异性，其中最常见的是单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)［1，2］。

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶［poly(ADP ribose)polymerase，PARP］是一个能选择性识别并结合DNA缺口的DNA结合蛋白酶，人的PARP组成一个有17个成员的大家族，其中PARP－1是原型。PARP－1基因存在多个单核苷酸多态性位点，其中某些位点被报道与恶性肿瘤的易感性相关［3］。

回族是我国的一个重要的民族。根据2000年第5次人口普查数据，甘肃回族人口为118．49万人，居全国第二。甘肃临夏回族自治州是全国两个回族自治州之一。回族在临夏州境内的总人口约61万人。王德增等［4］发现回族胃癌患病率可能较高。其原因可能与遗传及回族大部居住高原和饮食特点(冬春季节较长，多以腌菜为主)有关。苏芳贤等［5］在3269例回族胃镜检查中，检出胃癌431例，胃癌检出率为13．2%。因此，探讨回族胃癌发病机制、易感因素、治疗方法及预防措施具有重要的意义。唐小凡等［6］研究表明COX－2－765G＞C和中国甘肃地区回族人群胃癌易感性增高相关。目前尚未见 PARP－1Val762Ala基因多态性与回族人群胃癌易感性方面的文献报告。本研究旨在探讨临夏回族自治州回族人群中PARP－1基因多态与胃癌易感性之间关系。

资料与方法

1．一般资料:研究对象均为甘肃临夏回族自治州居民(20岁以上，居住满20年以上，3代无族外通婚的回族居民)。分胃癌组(200例)、正常对照组(210例)。胃癌组为2007年9月～2010年5月在甘肃临夏及兰州地区二级甲等以上医院住院或接受胃镜检查并满足上述条件的回族居民，均经组织病理学确诊。正常对照组:来自同一时期该地区按性别、年龄(±5岁)配对，并排除肿瘤和消化系统疾病的健康回族志愿者。征得研究对象同意，并采集以下信息:a．人口学特征，如年龄、性别等;b．胃癌家族史(家族中有1名以上一级亲属或2名以上二级亲属患有胃癌者为阳性);c．食腌菜史(自行拟定标准为每周≥5次，每次≥50g，≥6个月/年，连续3年以上)。经调查，回族不吸烟、不喝酒，所以本研究未涉及吸烟、饮酒史。每位研究对象自愿贡献外周静脉血5ml(EDTA抗凝)，－70℃冰箱保存。

2．实验方法:研究对象的基因组DNA样品从外周血淋巴细胞中分离。使用幽门螺杆菌IgG酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测是否有H．pylori感染。扩增引物参照文献，上游引物:5'－GCCCTCTGACATGTTTCTCC－3'，下游引物5'－AAGGAGGGCACCGAACAC －3'，由 Sangon公司合成(PAGE纯化)［7］。PCR扩增在50μl反应体系中进行，包括10× Buffer5μl，4 × dNTPs 10mmol/L 5μl，25mmol/L MgCl26μl，引物(50μmol/L)各 1μl，Tag 酶 0．2μl，模板 3μl，去离子水 29μl。反应条件:94℃ 预变性 5min，然后按 94 ℃30s、62℃30s、72℃45秒的顺序进行35个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物用内切酶Tail进行消化，酶切反应体系为20μl，其中PCR产物10μl，2 ×Buffer2μl，内切酶1μl(10 个单位)，去离子水 7μl。37℃温育过夜。3%琼脂糖凝胶100V电泳检测酶切结果。酶切后Ala/Ala型无酶切位点，产生100bp一条片段;Val/Val型产生80bp和20bp两条片段;Val/Ala型经酶切后产生100bp、80bp和20bp 3条片段。其中20bp的片段与引物二聚体在凝胶上难以分辨。

3．统计学方法:两组之间年龄性别差异用t检验比较。χ2检验比较两组之间性别、家族史、食腌菜、H．pylori感染和各基以非条件Logistic回归计算比值比(odds ratio，OR)及其95%可信区间(confidence interval，CI)评价各基因型与胃癌发病风险的关系。所用统计学分析软件为SPSS 13．0。所有统计检验均为双侧概率检验。检验水准α=0．05。p＜0．05为差异具有显著性。

结 果

1．胃癌组与正常对照组在家族史、食腌菜、H．pylori感染率方面的比较:胃癌组与正常对照组比较，家族史阳性率、食腌菜、H．pylori感染率均有统计学差异(P=0．000)(表 1)。

表1 胃癌组与正常对照组在家族史、食腌菜、H．pylori感染率方面的比较［n(%)］

2．基因型频率分布及与胃癌的关系:表2所示PARP－1 Val762Ala的基因型频率分布均符合Hardy－Weinberg平衡规律(P=0．348，0．067)。PARP －1 762Val/Ala、Ala/Ala分别与Val/Val比较，两组之间差异无统计学意义(P＞0．05)，但Val/Ala+Ala/Ala在胃癌组显著增高(P=0．020)。

3．基因型的分层分析:表3示:在年龄、性别、家族史、食腌菜分层分析中未观察到基因型分布差异。在H．pylori感染阳性人群中，PARP－1 Val/Ala+Ala/Ala基因型患胃癌的风险是Val/Val基因型的1.748 倍(OR=1．748，95%CI:1．016 ～ 3．008，P=0.043)。

表2 PARP－1基因型在3组中的分布及其与胃癌的关系［n(%)］

表3 PARP－1Val762Ala基因多态性与胃癌相关性的分层分析

4．家族史、食腌菜、H．pylori感染与 PARP－1 Val762Ala交互作用对胃癌发病风险的影响:分别以家族史阴性、不食腌菜、H．pylori感染阴性的正常对照组中基因型为Val/Val的个体为对照，家族史阳性的胃癌组Val/Ala+Ala/Ala基因型患胃癌的风险是家族史阴性的正常对照组Val/Val基因型的4.125倍(OR=4．125，95%CI:2．117 ～8．038，P=0．000)，大于家族史阴性的胃癌组对家族史阴性的正常对照组OR值与家族史阳性的胃癌组对家族史阳性的正常对照组OR值乘积;食腌菜的胃癌组Val/Ala+Ala/Ala基因型患胃癌的风险是不食腌菜的正常对照组 Val/Val基因型的 3．814 倍(OR=3．814，95%CI:2.150 ～6．766，P=0．000)，大于不食腌菜的胃癌组对不食腌菜的正常对照组OR值与食腌菜的胃癌组对食腌菜的正常对照组OR值乘积;H．pylori感染阳性的胃癌组Val/Ala+Ala/Ala基因型患胃癌的风险是H．pylori感染阴性的正常对照组Val/Val基因型的4．085 倍(OR=4．085，95%CI:2．197 ～ 7．597，P=0.000)，大于 H．pylori感染阴性胃癌组对 H．pylori感染阴性的正常对照组的OR值与H．pylori感染阳性的胃癌组对H．pylori感染阳性的正常对照组的OR值乘积，可见Val/Ala+Ala/Ala基因型分别与家族史、食腌菜、H．pylori感染对胃癌的发生具有加乘交互作用。

讨 论

1．PARP－1 Val762Ala基因多态性与胃癌易感性:PARP－1主要通过修复DNA单链及双链断裂在维持基因组的完整性方面发挥作用［8］。PARP－1基因存在着丰富的单核苷酸多态性，尤其是Val762Ala位点的多态可下调酶的活性，与人类多种肿瘤相关［9］。Shiokawa 等［10］在人类生殖肿瘤细胞中发现了PARP－1 Val762Ala的基因多态性。Zhang等［11］的研究显示在中国汉族人群中，PARP－1 Val762Ala多态与吸烟相关的肺癌发病风险增高相关。本研究发现携带PARP－1 Val/Ala+Ala/Ala基因型的个体患胃癌的风险是Val/Val携带者的2.158倍(P=0．020)。胃癌组的Ala等位基因频率明显高于正常对照组的Ala等位基因频率(P=0．000)。通过数据分析，我们认为PARP－1 Val762Ala多态性与临夏回族自治州回族胃癌的发病风险相关。

2．胃癌家族史、食腌菜、H．pylori感染与 PARP－1 Val762Ala的交互作用对胃癌发病风险的影响:胃癌有明显的家族聚集现象，家族发病率高于人群2～3倍［12，13］。一般认为遗传素质使致癌物质对易感者更易致癌，人体对内外源性致癌剂的代谢能力和基因修复能力等因素将影响个体对胃癌的易感性。本研究发现胃癌组的家族史阳性率高于正常对照组(P=0．000)。交互作用分析证明 PARP－1 Val/Ala+Ala/Ala基因型与家族史对胃癌的发生具有加乘交互作用。

李玉民等［14］研究发现腌菜中亚硝基化合物含量较高，经常食用腌菜人群的胃液中的硝酸盐和亚硝酸盐含量均明显高于不常食用者。硝酸盐和亚硝酸盐可在胃内经细菌作用形成直接致癌的亚硝酰胺，它可以与DNA高分子结合导致基因突变。张龙杰等［15］研究表明腌菜有致癌作用，因为该类食物中含有大量的亚硝酸盐，在胃中可转化为强致癌化合物。本研究发现在胃癌组食腌菜的比例(42．0%)明显高于正常对照组(21．4%)。交互作用分析发现PARP－1 Val/Ala+Ala/Ala与食腌菜对于胃癌的发生具有加乘交互作用。

H．pylori是引发胃癌的主要因素之一。1994年国际癌症研究中心将H．pylori列为Ⅰ类致癌因子。H．pylori在世界范围感染率高达50%左右，我国不同地区、不同民族人群胃内H．pylori检出率为30% ～80%。H．pylori感染可能引起胃黏膜上皮细胞增殖动力学的改变，产生致癌物及毒素，甚至引起基因及其表达异常。Zhang等研究发现H．pylori感染中的Cag(+)与PARP－1762Ala/Ala基因型共同促进了胃癌的发生和发展。PARP－1的Val762Ala的基因变异可导致PARP－1酶活性下降，修复DNA损伤的能力降低。本研究发现PARP－1 Val/Ala+Ala/Ala基因型与H．pylori感染对胃癌的发生具有加乘交互作用。

由于涉及癌变过程的基因－基因、基因－环境因素相互作用关系错综复杂，因此，本研究所获得的这一结果有待于进一步扩大研究因素进行深入研究和探讨。

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4 王德增，张得希，李艳，等．高原地区胃癌发病的特点［J］．中华消化内镜杂志，1997，14(4):257 －258

5 苏芳贤，王志坚，杨文明，等．回族贲门癌102例报告［J］．宁夏医学杂志，2003，25(4):244

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13 张励，孙胜玫．大连地区胃癌遗传度的研究［J］．中华医学遗传学杂志，1995，12(5):45 －46

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15 张龙杰，吴宗辉，邹兴菊，等．消化系统癌症与饮食关系病例对照研究［J］．中国公共卫生，2008，24(5):539－540