Notch1受体和EGFR在颌骨成釉细胞瘤中的表达及其意义

杨文君 黄宏杰 刘 娟 吴翔燕 胡向荣

成釉细胞瘤(ameloblastoma，AM)是颌骨最常见的牙源性上皮性肿瘤，生物学行为具有局部侵袭性。从组织学上看，AM的主要亚型在某些方面与成釉器非常相似。以往的研究显示Notch1信号途径在成牙中起重要作用［1］。Notch1在牙发育早期阶段的表达与成釉细胞命运决定有关，但Notch1在AM中的作用仍不清楚。鉴于一些研究报道Notch1信号途径与其他信号途径如EGFR/Ras/MAPK在许多情况下存在直接或间接的交互作用，且EGFR在牙源性上皮和AM中广泛表达，因此本实验同时检测Notch1和EGFR在颌骨AM中的表达，旨在探讨Notch1和EGFR在 AM 中的作用［2，3］。

材料与方法

1．一般资料:本组69例AM标本，均选自浙江大学口腔医学院病理科1994～2005年间手术存档标本。其中男性41名，女性28名，年龄11～70岁(中位年龄33．7岁)。发生在下颌骨的62例，上颌骨的7例。实性/多囊型56例(其中滤泡型22例，丛状型27例，棘皮瘤型7例)，单房型13例。所有标本均用10%中性甲醛溶液固定并石蜡包埋，4μm连续切片，由2名病理专家确诊，组织学分类根据2005年WHO制定的标准确定［4］。5例牙胚组织做对照。

2．方法:一抗羊抗人Notch1多克隆抗体(sc－6014)和兔抗人EGFR单克隆抗体(sc－03)均购自美国的Santa Cruz公司，实验中稀释浓度分别为1∶75和1∶100，二抗试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司，所有操作步骤按试剂盒说明进行。用PBS代替一抗的切片作为阴性对照。已知Notch1阳性表达的正常口腔黏膜和EGFR阳性表达的舌鳞癌切片分别作为阳性对照。

3．结果判断:Notch1和EGFR蛋白阳性染色主要位于肿瘤细胞的胞膜，或胞膜及胞质均有阳性染色。阳性强度:无阳性染色为0分，弱阳性为1分，中等强度为2分，强阳性为3分。阳性细胞率为:0%为0，1% ～25% 为1，26% ～50% 为2，51% ～75% 为3，大于75%为4。每一切片总记分为阳性强度和阳性率的乘积。相应的评分有9个等级，即0、1、2、3、4、6、8、9、12。而且对实性/多囊型 AM 的每一例标本，分别对外周细胞和中央区细胞的染色情况进行记分评价。Notch1和EGFR的表达结果判定如下:评分0～1分为－，2～7分为+，≥8分为++。最后的记分为两名专家的平均分。

4．统计学方法:采用SPSS13．0统计学软件进行实验数据的统计学分析，p＜0．05认为有显著性差异。

结 果

所有标本均有Notch1和EGFR阳性染色。阳性染色主要位于肿瘤细胞的胞膜，或胞膜及胞质均有阳性染色，但阳性表达的强弱分布不同。5例牙胚组织中，Notch1和EGFR主要表达于内釉上皮，星网层细胞低表达(图1、图2)。对于AM，尤其实性/多囊型这一主要类型而言，高表达的Notch1和EGFR主要分布于肿瘤岛外周柱状或立方状细胞，而低水平的Notch1和EGFR表达主要位于中央星网状细胞(表1、图3～图8)。Notch1和EGFR在牙胚和AM中的表达比较，组间均无显著性差异(P＞0．05)(表2、表3)。在AM中，Notch1和 EGFR的表达非常相似，Notch1和EGFR的表达存在相关性(p＜0．05)(表4)。

讨 论

在牙胚和牙齿发育形成过程中，部分牙源性上皮细胞的分裂、分化和凋亡失去控制，细胞不能正常退化而保持分裂增殖的能力，在一系列基因及产物的调解下，残余的牙源性上皮细胞可以发展为成釉细胞瘤［5］。

Notch和EGFR信号途径是两条广泛存在且高度保守的信号转导通路，它们以不同的机制调控诸多的生命过程，在维持细胞增殖、分化和凋亡中起重要作用。Notch受体属于进化保守的I型跨膜糖蛋白受体家族。在哺乳动物细胞中，有4种 Notch受体(称Notch1，2，3，4)和5种配体［称 Jagged1，2和 Deltalike(Dll)1，3，4］［6］。这一信号途径通过邻近细胞受体－配体间直接相互作用而被激活。一旦激活，Notch通过连续的蛋白水解反应被截断，释放出胞内段(ICN，Notch的功能性激活形式)。ICN转位于细胞核内，与转录抑制子CBF－1相互作用，使CBF－1转变为转录激活子，从而调控多种靶基因的表达。研究表明，Notch信号通路对细胞的增殖、分化、凋亡、黏附、干细胞的维持和上皮间质转化均有十分重要的作用，是许多重要信号通路的交点［6］。许多肿瘤的发生均与Notch信号通路的异常有关。我们现在的研究发现Notch1在AM中广泛表达，这可能意味着Notch1与AM的发生、发展有关。

表1 Notch1和EGFR在AM中的表达

表2 Notch1在牙胚和AM中的表达比较

表3 EGFR在牙胚和AM中的表达比较

表4 AM中Notch1和EGFR的表达间的关系

EGFR作为受体酪氨酸激酶的ebB家族的成员之一已被广泛研究。EGFR在许多肿瘤如肺癌、肠癌、乳癌、前列腺癌等中的过表达往往与原始细胞的转化、肿瘤的发生发展、预后不良及生存率低有关［7］。文献报道，EGFR在一些正常组织如口腔黏膜及发育中的牙组织中表达，可能与细胞增殖、分化和凋亡有关［8］。我们的研究发现，所有的AM标本均有EGFR的表达，这一结果与文献报道的一致，提示AM可能起源于EGFR阳性表达的牙源性上皮。

Notch1与许多信号途径如EGFR存在交互作用，两者之间的相互作用取决于不同的组织背景，既可以表现为相互协同，也可表现为相互拮抗。已有研究表明，Notch1与EGFR信号通路之间存在着“串话”。例如:Notch1通过P53上调EGFR的表达［9］;在乳腺癌细胞中，Notch和EGFR之间存在“串话”，Notch1和EGFR在乳腺癌中的表达水平呈正相关，并发生相互协同、相互促进的作用［10，11］。本研究中，我们用免疫组化方法检测了Notch1受体和EGFR在AM中的表达，结果发现，所有标本Notch1受体和EGFR均阳性染色，且高水平的Notch1受体表达主要位于AM的外周柱状或立方状细胞中，而低水平的Notch1受体表达位于中央星网状样细胞。EGFR的表达与Notch1表达非常类似，Notch1和EGFR的表达存在相关性(p＜0．05)。因此，我们推测，在AM的发生过程中，Notch1和EGFR信号之间有协同作用，两条通路间可能存在着“串话”。

从组织学上看，AM肿瘤性上皮的分化水平似乎维持在牙发育的帽状期及钟状期阶段。在钟状期，Notch1和EGFR表达在内釉上皮，一旦其分化为成釉细胞，则 Notch1 和 EGFR 的表达为阴性［8，12］。亦有研究表明，AM细胞巢周边区PCNA的表达显著高于中心区，说明细胞巢周边区为细胞增殖区［13］。这意味着外周细胞而非中央细胞代表着AM细胞增生的活跃部分。有趣的是，我们现在的研究发现，Notch1和EGFR的强阳性染色均主要位于AM外周柱状或立方状细胞，此结果提示，Notch1和EGFR在AM中的作用可能是促进细胞增殖和抑制细胞分化。

综上所述，本研究显示，Notch1和EGFR蛋白明确地表达在AM中，其表达特征提示Notch1和EGFR在AM的发生中起潜在作用，并与肿瘤细胞的增殖有关。Notch1与EGFR的表达非常相似，因此我们推测，在AM的发生过程中，Notch1和EGFR信号之间有协同作用，两条通路可能存在着“串话”。

1 马亮，王胜朝，张亚庆．Notch信号与牙胚发育与牙齿损伤修复［J］．国际口腔医学杂志，2009，36(1):64 －68

2 Vered M，Shohat I，Buchner A．Epidermal growth factor receptor expression in ameloblastoma［J］．Oral Oncology，2003，39(2):138 －143

3 Payeras MR，Sant'Ana Filho M，Lauxen IS，et al．Quantitative analysis of argyrophilic nucleolar organizer regions and epidermal growth factor receptor in ameloblastomas［J］．J Oral Pathol Med，2007，36(2):99 －104

4 Philipsen HP，Reichart PA，Slootweg PJ，et al．Pathology and genetics．Head and neck tumours［M］．Lyon:IARCPress，2005:283 －327

5 Takata T，Zhao M，Uchida T，et al．Immunohistochemical demonstration of an enamel sheath protein，sheathlin，in odontogenic tumors［J］．Virchows Arch，2000，436(4):324 －329

6 李林，罗进勇．Notch信号通路及其与肿瘤的关系［J］．临床与实验医学杂志，2010，9(19):1509 －1511

7 Normanno N，De Luca A，Bianco C，et al．Epidermal growth factor receptor(EGFR)signaling in cancer［J］．Gene，2006，366(1):2 － 16

8 Davideau JL，Sahlberg C，Blin A，et al．Differential expression of the full－length and secreted truncated forms of EGF receptor during formation of dental tissues［J］．International Journal of Developmental Biology，1995，39(4):605 －615

9 Purow BW，Sundaresan TK，Burdick MJ，et al．Notch － 1 regulates transcription of the epidermal growth factor through P53［J］．Carciongenesis，2008，27(5):918 －925

10 Dai J，Ma D，Zang S，et al．Cross－ talk between Notch and EGFR signaling in human breast cancer cells［J］．Cancer Invest，2009，27(5):533－540

11 Lee CW，Raskett CM，Prudovsky I，et al．Molecular dependence of estrogen receptor－negative breast cancer on a notch－survivin signaling axis［J］．Cancer Res，2008，68(13)5273 －5281

12 Thimios A，Mitsiadisa，Laure R，et al．Role of the Notch signalling pathway in tooth morphogenesis［J］．Archives of Oral Biology，2005，50(2):137－140

13 刘进忠，汪说之，陈新明，等．成釉细胞瘤肿瘤细胞巢周边及中心区细胞增殖和分化的研究［J］．中华口腔医学杂志，2002，37(1):62－64