β伴大豆球蛋白糖基化改性对其乳化性影响的研究

张 波，迟玉杰，2，*

(1.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030;2.大豆生物学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨150030)

大豆蛋白是一种重要的植物蛋白资源，具有较高的营养价值和独特的功能性质，乳化性是其在食品工业生产上重要的功能性质［1］。大豆中近90%的蛋白质是以贮藏蛋白的形式存在，其中主要是大豆球蛋白(11S)和β－伴大豆球蛋白(7S)。大豆蛋白的乳化性与这两种成分密切相关［2－3］。Rivas曾报道7S球蛋白的乳化性能要明显高于11S球蛋白［4］。目前，工业上生产的大豆分离蛋白(SPI)是11S和7S球蛋白的混合物，11S和7S各自的功能特性得不到充分体现，制约了大豆分离蛋白在食品加工中的应用。近年来，蛋白质与多糖的糖基化改性受到广泛地关注，经改性的蛋白质功能性(如水溶性、乳化性、疏水性及脂肪吸收力等)有很大地改善［5］。蛋白质的糖基化反应主要有干热法和湿热法［6］。湿热法较干热法相比，条件相对简单，反应速率快，主要用于蛋白质与单糖或双糖的接枝反应，而与多糖进行反应的报道相对较少，有研究表明，多糖的加入较单糖与双糖更能提高蛋白质的功能性质［7］。黄原胶(XG)具有独特的物理性质(高粘度，假塑性)和化学性质(高溶解性，pH稳定性)而被广泛地应用在食品工业生产中［8］。本文选用黄原胶对β－伴大豆球蛋白进行湿法糖基化改性，优化制备具有良好乳化性能的7S球蛋白改性条件，为高乳化性大豆蛋白的实际生产提供一定的理论依据，同时丰富功能专用型大豆蛋白的种类，并拓宽大豆蛋白在食品工业中的应用范围。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

低温脱脂豆粕(蛋白质:53.61%、脂肪:0.92%、灰分:5.80%、水分:9.1%) 黑龙江省哈高科大豆食品有限责任公司，经粉碎，过60目筛得脱脂豆粉;大豆油 九三集团哈尔滨惠康食品有限公司;邻苯二甲醛(OPA)Sigma公司;葡萄糖、乳糖、黄原胶 天津市天理化学试剂有限公司;十二烷基磺酸钠(SDS)化学纯;其他试剂均为分析纯。

LD4－2A型离心机 北京医用离心机厂;FDU－1200型冷冻干燥机 上海爱朗仪器有限公司;KND－HYP8型消化炉、KDN－2008全自动定氮仪上海纤检仪器有限公司;FS－1可调高速匀浆机 金坛市荣华仪器制造有限公司;TU－1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;荧光分光光度计(LS55) 美国Perkin－Elmer公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大豆7S球蛋白的制备 大豆7S球蛋白根据国际上普遍使用的 Thanh 等人［9］和 Nagano 等人［10］的经典方法为基础进行优化制备［11－12］。凯氏定氮法测定β－伴大豆球蛋白的蛋白质含量为92.30%(N×6.25)。

1.2.2 分析方法 蛋白质含量按GB 5009.5－2010，使用凯氏定氮法测定，蛋白质转换算系数以6.25计。水分按GB 5009.3－2010测定。灰分按GB 5009.4－2010测定。

1.2.3 SDS－PAGE电泳 用SDS－PAGE非连续凝胶电泳对1.2.1中提取的大豆7S球蛋白组分进行分析，浓缩胶和分离胶的质量分数分别为4.0%和12%，考马斯亮蓝R－250染色。用BandScan5.0软件对电泳凝胶图像进行分析。

1.2.4 乳化活性及乳化稳定性的测定 本实验采用浊度法测定［13］，略作改进:用 pH7.0，0.1mol/L 的磷酸盐缓冲溶液配制100mL 0.5%(m/v)的蛋白悬浮液，取30mL蛋白液于高速匀浆机中，加入10mL大豆油，10000r/min均质1min以形成乳浊液，均质后，分别在0min与10min时从底部吸取100μL分散于10mL 0.1%SDS(m/v)中，于500nm处测定吸光度值(测定三次取平均值)，以A0表示乳化活性(EAI)，乳化稳定性(ESI)的表示方法为:

式中:A0:0min时的吸光度值;t:测定乳化性的两次时间间隔，本实验取10min;A10:10min时的吸光度值。

1.2.5 糖基化蛋白的制备 根据N Diftis等人［14］的实验方法，称取一定量的β－伴大豆球蛋白，溶于0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)，按一定比例添加糖，充分搅拌溶解。将烧杯用保鲜膜封口，放置到一定温度的水浴中恒温反应，每间隔30min取样，装到离心管中，冰浴冷却后1500g离心15min除去不溶物，上清液4℃透析24h，冻干得到糖基化产物。

1.2.6 糖基化程度测定 采用OPA法对蛋白中糖基化程度(DG)进行测定［15］。

1.2.7 表面疏水性的测定(H0) 表面疏水性是用1－苯氨基萘－8－磺酸(ANS)作为荧光探针进行测定［16］。

1.2.8 溶解度的测定 蛋白质溶解性采用氮溶解指数(NSI，%)表示，采用 Lowry 法［17］测定。

1.2.9 褐变程度的测定 取反应后样品液2mL，加入2mL稀释液(含质量分数10%SDS，0.05mol/L硼砂)，以蒸馏水(稀释液)做空白，测420nm处的吸光值，褐变程度以吸光值大小表示［18］。

1.2.10 实验设计 根据单因素实验结果与实际生产要求选取合适的因素水平，并根据螺旋中心组合设计原理，采用软件 Design Expert 7.1中 Box－Behnken模型对反应条件进行优化。各因素水平编码表如表1所示。

表1 实验因素水平编码表Table 1 Experiment design for levels of factors

2 结果与分析

2.1 大豆7S球蛋白SDS－PAGE电泳分析

由图1可以明显看出，电泳图中大豆7S球蛋白三个亚基(α'，α，β)分离较明显，且泳带上几乎不存在大豆11S球蛋白的两个亚基染色带(AS，BS)，表明所提取的大豆7S球蛋白组分纯度较高。通过BandScan5.0软件对图像进行分析，得出7S组分纯度达89%以上。

图1 大豆11S蛋白和大豆7S球蛋白样品电泳图Fig.1 Electrophoresis picture of β－conglycinin and glycinin

2.2 湿法糖基化反应的单因素研究

本实验选择以黄原胶为糖基供体，分别对反应温度、反应时间、多糖添加量进行单因素实验，根据糖基化β－伴大豆球蛋白的乳化活性高低初步确定反应条件。

2.2.1 反应温度对乳化活性的影响 如图2所示，糖基化β－伴大豆球蛋白乳化活性随反应温度升高呈现先增加后降低的趋势，反应温度对糖基化产物具有显著影响(p＜0.01)。糖基化改性的目的是在蛋白分子结构改变较小的情况下，尽量增加蛋白质中亲水性基团的数量，从而使蛋白质达到更好的亲水亲油性的平衡。在一定范围内随反应温度升高，β－伴大豆球蛋白与糖共价交联速度加快，蛋白质结构展开，提高大分子表面活性，增加复合物亲水性，从而提高其乳化活性;但当反应温度继续升高超过一定程度时，蛋白质变性严重，共价复合物界面活性降低，导致糖基化β－伴大豆球蛋白乳化活性降低。

图2 不同反应温度对乳化活性的影响Fig.2 Effect of different reaction temperature on emulsifying activity index

2.2.2 反应时间对乳化活性的影响 结合图3可以看出，随着反应时间的增加，复合物的乳化活性呈现先上升后下降的趋势。当反应时间为2h时，乳化活性最高。这可能由于反应开始糖链的引入，羟基的亲水特性使得蛋白质的溶解性显著提高，糖基化改性的蛋白质部分可有效地吸附在油—水界面上，降低界面的张力，共价结合的糖分子(特别是多糖分子)链在吸附膜的周围形成立体网络状结构增加了膜的厚度和机械强度，从而增加了接枝物的乳化活性。随着反应到一定程度以后，其交联程度越来越高，使复合物过于亲水而失去界面活性，从而产物的乳化活性开始降低。

图3 不同反应时间对乳化活性的影响Fig.3 Effect of different reaction time on emulsifying activity index

2.2.3 糖添加量对乳化活性的影响 蛋白和多糖的分子间共价结合是在一定的基团间进行的，适当的反应物配比不仅可以提高反应的速度和最终的反应程度，而且还可以减少副反应(如焦糖化)的发生。由图4可以发现，糖添加量对糖基化蛋白乳化活性具有显著影响(p＜0.01)，随着糖的添加量增加而呈现出先上升后下降的趋势。糖的添加量为7%时，蛋白的乳化活性最大。

2.3 响应面实验优化结果

2.3.1 响应面实验设计方案及实验结果 根据实验因素水平编码表，响应面实验设计方案及结果见表2:

以乳化活性和乳化稳定性为响应值，运用Design expert 7.1软件对实验数据进行回归拟合分析，建立各因子对响应值的回归方程:

图4 不同黄原胶添加量对乳化活性的影响Fig.4 Effect of adding contents of different xanthan gum on emulsifying activity index

表2 实验设计条件及结果Table 2 Design and results of experiment

由表3的方差分析可以看出，乳化性和乳化稳定性回归方程模型F检验显著(p＜0.05)，EAI/ESI失拟项不显著(0.4860＞0.0500;0.2062＞0.0500)，说明回归方程的拟合程度较好，实验误差较小，同时，模型的决定系数(0.9977)均大于0.8000，因此，该模型可用于预测不同条件下糖基化复合物的乳化性，也可用于优化湿法糖基化反应条件。

2.3.2 响应面的优化 根据复合物乳化活性和乳化稳定性模型的二次回归方程，利用Design Expert 7.1软件对湿法糖基化反应工艺条件进行优化，如图5～图6。以乳化活性为响应值，反应温度为89.19℃，反应时间为2.08h，糖添加量为6.82%，乳化活性可以达到1.062;而以乳化稳定性为响应值，反应温度为90℃，反应时间为2.13h，糖添加量为7.54%，乳化稳定性可以达到27.22min。考虑到具体实验的可操作性，以减少能量损耗和反应时间为基准，选择反应温度为90℃，反应时间为2h，糖添加量为7%条件下进行了5次验证实验(数据未显示)，乳化活性平均为1.132，乳化稳定性平均为27.16min，验证实验结果与理论预测值接近，表明Box－Behnken模型优化可用

于糖基化反应条件优化，所得参数准确可靠，具有实用价值。由表4可以看出，经优化后的糖基化β－伴大豆球蛋白的乳化活性和乳化稳定性分别是未经处理7S的2.15倍和2.26倍，增加了蛋白质的表面疏水性和溶解性，且褐变程度不明显;对比发现单独的添加黄原胶(不加热)没有明显改善大豆7S球蛋白的表面疏水性、溶解性及乳化性;此外发现7S球蛋白经90℃加热2h后乳化性明显降低。这可能是由于蛋白质加热破坏了蛋白质的分子结构，促使蛋白质内部的疏水基团暴露，表面疏水性提高，溶解性降低造成的。

表3 乳化活性/乳化稳定性回归方程的方差分析表Table 3 Variance and significant analysis for regression equation of EAI/ESI

表4 空白与糖基化改性β－伴大豆球蛋白性能的比较(pH7.0)Table 4 Comparison of the properties between native and glycosylation modification 7S at pH7.0

图5 乳化活性影响因素的响应面分析Fig.5 Response surface analysis of factors influencing EAI

图6 乳化稳定性影响因素的响应面分析Fig.6 Response surface analysis of factors influencing ESI

3 结论

3.1 单因素实验结果表明，反应温度、反应时间、黄原胶添加量均对制备复合物乳化活性和乳化稳定性影响显著(p＜0.01)。

3.2 利用Box－Behnken模型对湿法糖基化β－伴大豆球蛋白的制备技术进行了优化，方差分析表明拟合较好。结果表明多糖黄原胶与β－伴大豆球蛋白湿法糖基化反应能够显著改善复合物的乳化性。优化条件为:反应温度90℃，反应时间2h，糖添加量7%，乳化活性(EAI)为1.132，乳化稳定性(ESI)为27.16，分别是未改性7S球蛋白的2.15倍和2.26倍。

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