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比色法测定不同产地黑豆皮中花青素含量

2012-12-03张泽生林纪伟王志平於洪建刘岱琳

食品研究与开发 2012年5期
关键词:皮中甲醇溶液项下

张泽生,林纪伟,2,王志平,於洪建,刘岱琳

(1.天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457;2.中国人民武装警察部队医学院生药教研室,天津 300162;3.郑州人民医院药剂科,河南 郑州 450012;4.天津市尖峰天然产物研究开发有限公司,天津 300457)

黑豆是我国一种传统种植的农作物,其具有悠久的食用和药用历史,自古以来民间就有用黑大豆补血、活血和乌发养颜的记载。黑豆皮,又称乌衣,富含大量花青素,主要以飞燕草素、矢车菊素为主[1],具有抗氧化活性[2]、抑制诱变[3-4]、抗炎[5]、预防癌症以及延缓衰老等多种保健功效[6],一直是天然食用添加剂和健康保健食品的原料。

我国是农业大国,从南到北很多省份都种植黑豆,资源丰富,可谓世界各国之首[6]。在我国的北方,如天津市、河北省、山东省都有丰富的黑豆产量,但是由于产地不同,黑豆皮中的功效成分差异较大,因此本文在文献工作基础上,利用比色法测定不同产地黑豆皮中花青素的含量,从而进一步控制黑豆皮的质量,为其在食品添加剂和保健食品中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器设备

1.1.1 材料

黑豆皮原料:黄仁黑豆皮,产自湖北;青仁黑豆皮,产至东北,青扁黑豆皮,产自安徽;市售黑豆皮,产自山东滨州;内蒙黑豆皮,产自内蒙古。所有试验黑豆皮原料由天津市尖峰天然产物研究开发有限公司提供。

1.1.2 试剂

飞燕草素标准品:挪威Polyphenols公司;无水乙醇、甲醇:均为分析纯,天津康科德化工有限公司;盐酸:天津大茂化工有限公司。

1.1.3 仪器设备

UV-2401PC:日本岛津公司;HZQ-QX型电动振荡机:东联电子技术开发有限公司。

1.2 方法

1.2.1 检测波长的确定

用1%盐酸甲醇溶液配制少量黑豆皮提取液,用UV-2401PC紫外可见分光光度计200 nm~600 nm的范围内对色素进行扫描,得黑豆皮提取液的吸附光谱图。同时对标准品溶液在200 nm~600 nm的范围内进行扫描,得到飞燕草素标准品溶液的吸附光谱图。

1.2.2 标准曲线的测定

1.2.2.1 标准溶液的配制

精密称取飞燕草素对照品适量,用1%盐酸甲醇溶液溶解,定容在100 mL容量瓶中,配制成85.211μg/mL的标准品储备液,备用。

1.2.2.2 标准曲线的测定

分别精密吸取 2、4、6、8、10 mL 标准品储备液转移至100 mL容量瓶中,用1%盐酸甲醇溶液稀释并且定容至刻度。在520 nm下测定吸光度,测定标准曲线。

1.2.3 黑豆皮提取物样品溶液的配制

准确称取黑豆皮原料5 g加入浸提液浸泡过夜,过滤,测定其体积为V。精密吸取1 mL样品浸提液,置1000 mL棕色容量瓶中,用1%的盐酸甲醇定容到刻度,以同批1%盐酸甲醇溶液作空白,置520 nm处测定其吸收度。花青素含量利用1.2.2.2中的标准曲线进行测定。

1.2.4 黑豆皮中花青素提取条件优化

1.2.4.1 提取溶剂的选择

准确称取黑豆皮5 g,共4份,分别置于100 mL三角瓶中,分别加入甲醇、95%乙醇,1%盐酸甲醇50 mL和1%盐酸乙醇各50 mL,浸提8 h。按照1.2.3项下配制方法进行样品制备,测量其吸光度。通过对甲醇、95%乙醇、含有体积比例为1%盐酸的甲醇溶液和95%乙醇溶液进行考察,确定最佳提取溶剂。

1.2.4.2 提取溶液盐酸用量的选择

准确称取黑豆皮5 g,共5份,分别置于100 mL三角瓶中。分别加入甲醇50 mL、0.5%盐酸甲醇溶液(体积分数)50 mL、1%盐酸甲醇溶液(体积分数)50 mL、1.5%盐酸甲醇溶液(体积分数)50 mL、2%盐酸甲醇溶液(体积分数)50 mL,浸提8 h。按照1.2.3项下配制方法进行样品制备测量其吸光度。

1.2.4.3 提取时间的选择

准确称取黑豆皮5 g,共6份,分别置于100 mL三角瓶中,精密加入1%盐酸甲醇50 mL。6份样品,密封状态下进行提取,提取时间分别为 1、2、4、6、8、10 h。然后按照1.2.3项下配制方法进行样品制备,测量其吸光度。

1.2.4.4 料液比的选择

准确称取黑豆皮5 g,共5份,分别置于100 mL三角瓶中。分别加入 1%盐酸甲醇 10、25、50、75、100 mL。密闭状态下进行浸提8 h。然后按照1.2.3项下配制方法进行样品制备,测量其吸光度。

1.2.5 加样回收率的测定

精密称取已知含量的供试品原料5 g,准确加入与供试品中花青素含量相同的飞燕草素对照品,按照1.2.4中确定的提取方法进行提取,按1.2.3项下确定的方法准确测定,计算平均回收率。

1.3 样品的含量测定

分别准确称取不同产地的黑豆皮5 g,按照1.2项下确定的最优提取方法进行提取,按照1.2项下的含量测定方法进行含量测定。每个产地的黑豆皮平行测定3次。

2 试验结果

2.1 检测波长的确定

图1a是黑豆皮提取物在1%盐酸甲醇溶液中的吸收光谱,从光谱中可以看出黑豆皮提取物分别在520、362、279、205 nm 处有吸收峰,而 520 nm 为花青素类色素的特征吸收峰。图1b是标准品飞燕草素在1%盐酸甲醇溶液中的吸收光谱,从光谱中可以发现其在520、360、280 nm处有吸收峰,综合分析后,选择520 nm作为黑豆皮提取物中花青素吸收度的检测波长。

2.2 标准曲线的测定及方法学考察

2.2.1 标准曲线的测定

按照1.2.2.2项下方法进行测定,结果如图2所示。

图1 黑豆皮提取物和标准品的紫外吸收图谱Fig.1 The UV spectrum of Black Soya Bean Extract and delphinidin

图2 标准曲线的测定Fig.2 Detection of linear curve

标准曲线为A=0.0943x,(x表示为测试溶液的浓度,单位为 μg/mL),r=0.9996(n=5),该标准曲线在浓度为1.7μg/mL~8.5μg/mL的范围内线性良好。

2.2.2 精密度的测定

吸取标准品溶液1 mL,按1.2.2.2项下的方法进行精密度测定,RSD=0.21%(n=6),本方法的精密度良好。

2.2.3 稳定性的测定

吸取供试品溶液 1 mL,分别在 2、4、6、8、10 h 后测定吸光度值。试验结果表明:在0~10 h内稳定性良好,RSD=0.23%。

2.2.4 重现性试验

准确称取同一产地的黑豆皮5份,每份5 g。按1.2.4项下确定的方法进行提取,再按1.2.3项下方法进测定,实验结果显示,该方法重现性良好,RSD为0.74%(n=5)。

2.3 黑豆皮中花青素提取条件优化

2.3.1 提取溶剂的选择

不同溶剂的浸提结果见表1。

表1 不同溶剂的浸提结果Table 1 Extraction using different solution

表1测试结果显示采用1%的盐酸甲醇溶液作为提取溶剂时,吸光度最高,说明具有很好的提取效果。因此本试验采用1%的盐酸甲醇作为提取溶剂。

2.3.2 提取溶剂酸度选择

不同盐酸浓度的浸提结果见表2。

表2 不同盐酸浓度的浸提结果Table 2 Extraction using different content HCl

测试结果如表2,在相同提取时间条件下,随着盐酸浓度的增加,测试溶液的吸光度值也在增高。说明酸度的增加会提高提取收率。但是从1%~2.5%的酸度变化,提取溶液的吸光度值增加并不明显,因此确定提取溶液盐酸浓度为1%。

2.3.3 提取时间的选择

不同时间的浸提结果见表3。

表3 不同时间的浸提结果Table 3 Extraction using different time

如表3所示,浸提时间达到8 h时,吸光度值达到最高,而且随着提取时间的增加,吸光度值达到稳定。因而确定浸提时间为8 h。

2.3.4 料液比的选择

不同料液比的浸提结果见表4。

表4 不同料液比的浸提结果Table 4 Extraction using different volume solution

通过对不同料液比的考察,结果如表4所示,料液比为1∶10时,吸光度值达到最高,因而确定最佳料液比为 1∶10。

2.4 加样回收率的测定

按照1.2.5项下确定的方法准确测定,平均回收率为 98.34%,RSD=2.32%(n=5)。

2.5 不同产地黑豆皮中花青素的含量

按照1.2.4项下确定的提取方法进行含量测定,结果如表5所示。分析结果如表5所示,市售的黑豆皮其花青素含量相对较低,而安徽产的青扁黑豆皮花青素含量相对较高。

表5 不同产地黑豆皮中花青素的含量测定Table 5 Detection of anthocyanidin of black soybean from different varied area

3 小结与结论

1)对国内不同产地的黑豆皮原料进行了花青素含量测定,测试结果显示不同产地的黑豆皮原料中花青素的含量差异较大,品种之间以安徽产的青扁黑豆皮花青素含量相对较高,虽然市售黑豆皮的含量相对较低。

2)本文利用紫外分光光度法测定不同区域的黑豆皮中花青素的含量,该方法简便,快速,结果准确,可靠,适于黑豆皮中花青素成分的质量控制。

[1]JINHL,KANGNS,SHINSO,et al.Characterisation of anthocyanins in the black soybean (Glycine max L.)by HPLC-DAD-ESI/MS analysis[J].Food Chemistry,2009,112:226-231

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[3]WANG Yen-ju,SHEEN Leen-yan,CHOU Cheng-chun,et al.Storage effects on the content of anthocyanin,mutagenicity and antimu-tagenicity of black soybean koji[J].LWT-Food science and technology,2010,43:702-707

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[6]李莹,张亮,刘志玲,等.黑豆种植与加工利用[M].北京:金盾出版社,2006:5-8

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