气质联用法测定空心胶囊中的邻苯二甲酸酯

曾金红，江涛，焦新萍，郑云峰，林海娃，宋海燕，黄晓丽

（绍兴市质量技术监督检测院国家黄酒产品质量监督检验中心,浙江 绍兴 312071）

邻苯二甲酸酯（phthalate esters）是邻苯二甲酸形成的酯的统称，又称酞酸酯，缩写PAEs，俗称塑化剂，作为塑料的增塑剂，可增大产品的可塑性和柔韧性，广泛地应用于药物载体、驱虫剂、染料助剂、涂料以及润滑油中[1-3]。研究表明，PAEs具有雌激素的特征及抗雄激素生物效应[4-6]，会干扰动物和人体正常的内分泌功能,引起动物与人体内分泌系统紊乱,在体内长期积累会对人体的生殖系统、免疫系统、消化系统带来危害[7-9]。PAEs可通过饮水、进食、皮肤接触和呼吸等途径进入人体[10-12]，这类化合物已成为全球性的主要环境有机污染物。

传统空心胶囊的成分为明胶、食用色素及其它材料等；它是一种特殊的药物和食品辅料，随药物制剂或食品一起进入人体消化系统，为人体所吸收[13-14]。曾报道过药品及保健品检测出含有邻苯二甲酸二丁酯（DBP）、邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP）及邻苯二甲酸二异壬酯（DINP）等邻苯二甲酸酯类物质。《中华人民共和国药典》（2010版）第二部药用辅料中将邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯3种邻苯二甲酸酯类物质列为药用辅料。据了解，上述物质在药品生产过程中主要作为辅料使用，多用于片剂包衣、空心胶囊等[15]。

2011年6月，中华人民共和国卫生部办公厅发布了《卫生部办公厅关于通报食品及食品添加剂邻苯二甲酸酯类物质最大残留量的函（卫办监督函[2011]551号）》，其中明确指出“食品容器、食品包装材料中使用邻苯二甲酸酯类物质，应当严格执行《食品容器、包装材料用添加剂使用卫生标准》（GB9685-2008）规定的品种、范围和特定迁移量或残留量，不得接触油脂类食品和婴幼儿食品，食品、食品添加剂中的邻苯二甲酸二（α-乙基已酯）（DE-HP）、邻苯二甲酸二异壬酯（DINP）和邻苯二甲酸二正丁酯（DBP）最大残留量分别为 1.5、9.0、0.3 mg/kg。”欧盟指令 2007/19/EC 规定了DEHP、DBP、DINP等几种PAEs在食品中的特定迁移量限值，如 DEHP、DBP、DINP 的限值分别为 1.5、0.3、9 mg/kg[16]。

国家食品药品监督管理局在《关于含邻苯二甲酸酯类保健食品有关辅料替代事宜的通知》（国食药监保化[2011]337号）中，要求保健食品配方中含邻苯二甲酸酯类（塑化辅料）物质的，申请人应当申请使用枸橼酸三乙酯、三乙酸甘油酯或其他符合相关规定的物质，替代邻苯二甲酸酯类物质，或者申请从配方中去除邻苯二甲酸酯类物质。

目前，明胶在许多食品、药品和保健品中被广泛应用，因此其质量安全性直接关系到食品、药物成品或保健品的质量安全。为了解市场上食品、药品及保健品包衣材料空心胶囊中塑化剂的情况，本实验对25批市售的空心胶囊进行邻苯二甲酸酯类物质检测，结果显示气相色谱-质谱法灵敏度高，操作简便、精确且针对性强、效率高。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 6890N-5973GC/MS气相色谱-质谱仪：美国安捷伦公司；离心机：上海天美；超声波发生器：上海科导公司；均质器：美国SBI公司，Milli-Q纯水仪，微孔膜：美国Milipore公司；等。

邻苯二甲酸二甲酯（DMP），邻苯二甲酸二乙酯（DEP），邻苯二甲酸二异丁酯（DIBP），邻苯二甲酸二丁酯（DBP），邻苯二甲酸二（2-甲氧基）乙酯（DMEP），邻苯二甲酸二（4-甲基-2-戊基）酯（BMPP），苯二甲酸二（2-乙氧 基）乙酯（DEEP），邻苯二甲酸二戊酯（DPP），邻苯二甲酸二己酯（DHXP），邻苯二甲酸丁基苄基酯（BBP），邻苯二甲酸二（2-丁氧基）乙酯（DBEP），邻苯二甲酸二环己酯（DCHP），邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP），邻苯二甲酸二苯酯（DPhP），邻苯二甲酸二正辛酯（DNOP），邻苯二甲酸二壬酯（DNP）标准品来自德国Dr,Ehrenstorfer公司；正己烷，色谱纯。水由Milli-Q超纯水系统制备，其他试剂均为重蒸馏分析纯或色谱纯，储存于棕色玻璃瓶中。空心胶囊为市场上任意挑选。

所用玻璃器皿洗净后用重蒸水淋洗3次，丙酮浸泡1 h，在200℃下烘烤2 h，冷却至室温备用。

1.2 标准溶液的配制和样品处理

标准储备溶液：分别准确称取适量的邻苯二甲酸酯标准品，用正己烷溶解并定容，配制成100 mg/L的混合储备液，于4℃冰箱中避光保存。

前处理方法的优化：借鉴文献[17]的方法并加以改进，取空心胶囊适量，剪碎，称取1.0010 g，浸泡在50mL的超纯水中于室温下肿胀，然后在50℃水浴直至溶解；加乙醚50 mL，小心振摇，静置分层，量取乙醚层置蒸发皿中，水浴蒸干；用正己烷转移并定容至1.0mL，摇匀，微孔膜过滤，滤液供气相色谱-质谱检测。

空白试验：空白实验使用的试剂按样品前处理方法处理后，进行GC/MS分析；为保证试验数据的准确度，对所用溶剂进行本底空白扣除。

1.3 GC-MS检测条件

色谱条件：选用HP-25毛细管色谱柱（30m×0.32mm×0.25 μm）；载气为氦气（纯度）≥99.999%；进样口温度：250℃；程序升温：100℃保持1 min，以15℃/min的速度升温至120℃，再以5℃/min的速度升温至280℃保持2 min。后运行温度300℃；传输线温度：280℃；进样量：1 μL；柱流速：1.2 mL/min。

质谱条件：溶剂延迟：5min；离子源温度（EI）：230℃。扫描模式：全扫描模式。

2 结果与分析

2.1 前处理方法的优化

空心胶囊的主要成分-明胶在冷水中溶解度低，可缓慢吸水膨胀软化，且在此过程易产生乳化现象，即使超声也出现溶解不充分；因此，本实验对前处理进行优化：首先待空心完全膨胀后再用水浴加热，有助于加速胶体组织的解题溶解，可以大大改善这种状况；其次，用乙醚进行液-液萃取后，水浴蒸干，可减少空白胶囊中杂质干扰。实验结果表明图谱上杂质干扰现象明显改善。

2.2 邻苯二甲酸酯标准品出峰谱图

以16种混合PAEs标准品的溶液为样品进行液-液萃取，经气相色谱GC/MS分离测定，总离子流色谱图（TIC）见图1；保留时间、质谱特征离子及定量离子如表1所示。

2.3 线性回归方程及检出限

图1 16种邻苯二甲酸酯标准品溶液扫描总离子流色谱图Fig.1 The TIC picture of 16 mixed PAEs standard solutions

表1 16种邻苯二甲酸酯类化合物的保留时间及特征离子Table 1 Retention time and characteristic ions of 16 PAEs

配制一系列浓度为 0.5、2、4、8、10 mg/L 的邻苯二甲酸酯的混合标准溶液，以浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标，绘制校准曲线，标准线性回归方程和相关系数如表2所示。

表2 16种邻苯二甲酸酯类化合物线性方程、相关系数及检出限Table 2 Linear equation,correlation coefficient and limits of detection for each of sixteen kinds of PAEs

以10倍信噪比（S/N=10）和扣除溶剂空白后计算定量检测下限，16种邻苯二甲酸酯的检出限如表2所示。

2.4 回收率和精密度

分别进行0.5和4.0 mg/L浓度水平的加标回收试验，每个添加浓度按照确定的分析方法做6次平行测定，考察峰面积、精密度和回收率（扣除溶剂空白）。测得的回收率和相对标准偏差见表3。

表3 16种邻苯二甲酸酯类化合物加标回收率(n=6)Table 3 Recovery of sixteen kinds of PAEs at different concentrations added(n=6)

由表3可知，样品的回收率为72.52%～106.37%，相对标准偏差为2.25%～8.86%；表明仪器精密度良好，能够满足实际检测的要求。

2.5 样品测试

按1.2所述的优化方法处理空心胶囊样品，经检测（扣除溶剂空白），市售的25批空心胶囊中，4批空心胶囊检出含有DIBP和DBP两种邻苯二甲酸酯类化合物，1批空心胶囊检出含有DBP，数据见表4。

表4 空心胶囊中邻苯二甲酸酯类化合物平均含量Table 4 Contents of PAEs in vacant capsules

3 结论与讨论

用GC-MS联用分析技术测定了空心胶囊中邻苯二甲酸酯类化合物的含量，该方法在测定浓度范围内线性关系好，回收率和重现性良好，结果表明，在25批空心胶囊样品中，有4批空心胶囊检测含有邻苯二甲酸二异丁酯（DIBP）和邻苯二甲酸二丁酯（DBP）；1批空心胶囊中检出含有DBP。

邻苯二甲酸酯类物质对健康的影响取决于其摄入量，虽然偶然食用少量的邻苯二甲酸酯类物质不会对健康造成危害，但是在药品生产领域，应在产品说明书中标明药用辅料或包衣材料中邻苯二甲酸酯类等物质的含量，保证消费者的知情权。

[1]Howdeshell K L,Rider C V,Wilson V S,et al.Mechanisms of action of phthalate esters,individually and in combination,to induce abnormal reproductive development in laboratory rats[J]. Environ Res,2008,108:168-176

[2]Wittassek M,Wiesmüller G A,Koch H M,et al.Internal phthalate exposure over the last two decades—a retrospective human biomonitoring study[J].Int J Hyg Environ Health,2007,210(3/4):319-333

[3]黄永辉.SPE-GC-MS法同时测定奶粉中18种邻苯二甲酸酯迁移量[J].食品研究与开发,2010,31(11):167-170

[4]Mihovec Grdic M, Smit Z, Puntaric D, et al. Phthalates in underground waters of the Zagreb area[J].Croat Med J,2002,43(4):493-497

[5]Lee B M,Koo H J.Hershberger assay for antiandrogenic effects of phthalates[J].J Toxicol Environ Health,2007,70:1365-1370

[6]Howdeshell K L,Rider C V,Wilson V S,et al.Mechanisms of action of phthalate esters,individually and in combination,to induce abnormal reproductive development in male laboratory rats[J].Environ Res,2008,108(2):168-176

[7]Swan S H,Main K M,Liu F,et al.Decrease in anogenital distance among male infants with prenatal phthalate exposure[J]. Environ Health Persp,2005,113:1056-1061

[8]王硕,王琨,朱华平,等.气相色谱-质谱法检测食用油中的邻苯二甲酸酯[J].食品研究与开发,2010,31(9):127-130

[9]Matsumoto M,Hirata-Koizumi M,Ema M.Potential adverse effects of phthalic acid esters on human health:a review of recent studies on reproduction[J].Regu Toxicol Pharmacol,2008,50(1):37-49

[10]Schettler T.Human exposure to phthalates via consumer products[J].Int J Androl,29(1):134-139

[11]Wormuth M,Scheringer M,Vollenweider M,et al.What are the sources of exposure to eight frequently used phthalic acid esters in Europeans[J].Risk Anal,2006,26:803-824

[12]Wittassek M,Koch H M,Angerer J,et al.Assessing exposure to phthalates-the human biomonitoring approach[J].Mol Nutr Food Res,2011,55(1):7-31

[13]Gullapalli R P.Soft gelatin capsules(softgels)[J].J Pharm Sci,2010,99(10):4107-4148

[14]Kodjo Boady Djagny,Wang Zhang,Xu Shi-ying.Gelatin:a valuable protein for food and pharmaceutical industries:rewiew[J].Crit Rev Food Sci Nutr,2001,41(6):481-492

[15]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京:中国医药科技出版社,2010:1204-1207

[16]2007/19/EC.amending Drective 2002/72/EC relating to plastic materials and articles intended to come into contact with food and Council Directive 85/572/EEC laying down the list of simulants to be used for testing migration of constituents of plastic materials and articles intended to come into contact with foodstuffs[J].Official Journal of the European Union,2007,L91:17-36

[17]北京市海淀区产品质量监督检验所(国家食品质量安全监督检验中心).GB-T 21911-2008食品中邻苯二甲酸酯的测定[S].北京:中国标准出版社,2008