化风丹对小胶质细胞介导的神经炎症反应的抑制作用＊

张 锋，吴 芹，石京山，陆远富，刘 航，刘 杰

(1．遵义医学院药理学教研室暨贵州省基础药理重点实验室，贵州 遵义 563099;2．遵义医学院药学院，贵州 遵义 563099)

近年研究发现神经炎症反应在神经系统疾病的发生发展过程中起着非常重要的作用［1］，而小胶质细胞的激活被认为是神经炎症反应的关键所在［2］。因此，抑制小胶质细胞所介导的神经炎症反应将成为治疗神经系统疾病的重要靶点之一。化风丹(Hua Feng Dan，HFD)，创制于1644年，是世界上生产、销售时间最长的治疗脑部疾病的中成药。目前，化风丹在治疗中风偏瘫、癫痫、面神经麻痹、帕金森氏病、老年痴呆等脑部疾病有很好的疗效［3］。但是有关化风丹的中枢神经药理作用知之甚少，中外文献检索近乎空白。因此，本研究拟采用原代大鼠小胶质细胞培养，通过脂多糖(LPS)诱导小胶质细胞激活引起神经炎症反应，观察化风丹对小胶质细胞介导的神经炎症反应的抑制作用，为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 实验动物 Sprague－Dawley(SD)大鼠(第三军医大学大坪医院实验动物中心，许可证:SCXK2007－017)，♀♂兼用，体重200～250 g。

1．1．2 药品及试剂 化风丹(贵州万胜药业有限责任公司);LPS(美国Calbiochem公司);细胞培养试剂(美国Invitrogen公司);一氧化氮(NO)检测试剂盒(江西碧云天生物技术研究所);酶联免疫吸附试剂盒(ELISA)(美国R＆D systems公司);Trizol、RNA纯化试剂盒以及所有引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)。

1．1．3 仪器设备 超净工作台(苏州精华设备公司);倒置相差显微镜(日本Nikon公司);CO2注入式电热恒温培养箱(美国Thermo Electron公司);96孔板清洗仪、酶标仪、PCR仪(美国BIO－RAD公司)。

1．2 方法

1．2．1 原代大鼠小胶质细胞培养 无菌操作条件下取出出生后1 d的SD大鼠幼鼠的全脑，置于Dulbecco＇s minimum essential medium(DMEM)/F12 培养液中。将嗅球和小脑去除，然后剥除脑膜，对剩余脑组织实施机械吹打从而分离细胞。离心之后去除上清，把细胞悬浮在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中，以6×107个细胞接种到面积为175 cm2的培养瓶中。每4 d更换一次培养液，培养至14 d后，星形胶质细胞长满整个培养瓶底部，而小胶质细胞贴附在星形胶质细胞表面。振荡培养瓶1 h使小胶质细胞脱离星形胶质细胞而飘浮在细胞培养液中。收集细胞悬液，弃上清，将小胶质细胞按5×105/孔和1×105/孔的密度分别接种于24孔和96孔板中用于细胞相关指标的检测［4］。

1．2．2 实验分组及药物处理 实验随机分为空白对照组、化风丹组(0.3 mg/mL)、模型组(10 ng/mL LPS)、LPS+化风丹组(0.03、0.1 和 0.3 mg/mL)。化风丹通过二甲基亚砜(DMSO)溶解，将药物混悬液用细胞培养液稀释，实验所用DMSO浓度(＜0.05%)对细胞未产生任何毒性反应。细胞培养中先加入HFD作用30 min，再加入LPS处理，在不同的时间点进行相应的指标检测。

1．2．3 NO测定 由于一氧化氮的半衰期极短，很容易形成亚硝酸盐，所以通过Griess试剂检测培养液中亚硝酸盐的含量可以一定程度上反映NO的产生情况。具体步骤如下:将收集的细胞培养上清液与等体积的Griess试剂 (1．0%氨苯磺胺、0．1%萘乙二胺二氢氯化物和2．5%磷酸)混合，室温下避光反应10 min，通过分光光度计读取波长540 nm处的吸收值。样品的亚硝酸盐浓度根据亚硝酸钠配成的标准曲线来确定［5］。

1．2．4 实时反转录聚合酶链反应试验 (Realtime RT PCR)通过Real－time RT－PCR检测小胶质细胞内肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素－1β(IL－1β)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的表达。采用 Trizol从细胞中提取出总 RNA，通过RNA纯化试剂盒将提取出来的RNA纯化，在紫外分光光度仪上检测RNA纯度，通过反转录酶制备cDNA然后进行 PCR扩增［6］，以 β －actin作为内参，目的基因的结果与内参进行比较，并设置LPS组为100%，计算其余各组基因的相对表达量。引物序列(见表1)。

表1 PCR引物序列

1．2．5 酶联免疫吸附试验(ELISA) 将试剂盒中的Capture抗体用 PBS进行稀释，然后加入到ELISA专用96孔板中，室温过夜后，先用含PBS和0．05%Tween 20的缓冲液漂洗，再用含1%BSA的封阻液封阻。缓冲液漂洗3次，将待测样品稀释3倍加入96孔板中，室温孵育2 h后加入检测抗体再孵育2 h，漂洗3次，加入生物素蛋白标记的过氧化物酶孵育20 min，缓冲液漂洗3次，加入显色液孵育20 min，通过硫酸终止反应，在分光光度计上读取波长450 nm处的吸收值［7］。

1．2．6 统计学分析 实验数据以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS16．0统计软件对各组数据进行单因素方差分析，以 P＜0.05认为有统计学差异。

2 结果

2．1 HFD对小胶质细胞内 TNFα、IL－1β 和 iNOS mRNA表达的影响 原代大鼠小胶质细胞培养中，先加入HFD作用30 min，再加入LPS处理3 h，收集细胞进行Real－time RT PCR检测。表2所示，LPS(10 ng/mL)诱导小胶质细胞内TNFα、IL－1β和iNOS mRNA的过度表达。HFD能够显著抑制LPS所引起的炎症因子mRNA的过度表达。

表2 HFD对小胶质细胞内炎症因子mRNA表达的影响(x±s，n=3)

2．2 HFD对小胶质细胞培养上清液中NO含量的影响 小胶质细胞经过LPS处理24 h之后收集细胞培养上清液检测上清液中NO的含量。表3所示，LPS(10 ng/mL)显著增加细胞培养上清液中NO的含量。经过HFD预处理能够抑制LPS引起的NO含量升高。

2．3 HFD对小胶质细胞培养上清液中TNFα和IL－1β蛋白水平的影响 小胶质细胞经过LPS处理24 h后，检测细胞培养上清液中TNFα和 IL－1β的蛋白含量。表4所示，LPS(10 ng/mL)明显刺激小胶质细胞释放TNFα和IL－1β。HFD能够明显减少上清液中TNFα和 IL－1β的释放。

表3 HFD对小胶质细胞培养上清液中NO含量的影响(x±s，n=3)

表4 HFD对小胶质细胞培养上清液中TNFα和IL－1β蛋白水平的影响(x±s，n=3)，TNF2(pg/mL)2L －1β(pg/mL)。

3 讨论

近年来研究发现神经炎症反应被认为是多种神经系统疾病，例如脑外伤、脑中风、阿尔茨海默病、帕金森病以及多发性硬化症等疾病的主要诱因之一［8］。而小胶质细胞是神经炎症反应的关键环节［2］。小胶质细胞是脑内常驻的免疫细胞，是机体抵御损伤和感染的第一道防线。在生理情况下，它主要起到免疫监视、免疫防御和组织修复的作用［9］。当脑损伤或受到炎性刺激时，小胶质细胞被激活同时释放多种炎性因子和细胞毒性物质，这些神经毒性介质的不断产生和积累从而决定了周围神经元的存亡尤其是对神经退行性疾病的发生和发展起到关键作用［10］。因此，抑制小胶质细胞的激活将成为治疗神经炎症反应导致的神经系统疾病的关键所在。

激活的小胶质细胞产生的大量炎性介质不仅进一步诱导细胞内的免疫反应，更重要的是造成神经细胞的变性损伤。在这些炎性介质中，除了活性氧自由基以外，TNFα、IL－1β以及NO都被认为是诱导神经细胞变性死亡的最主要的炎性因子［8］。此外，通过对神经退行性疾病病人尸检发现脑内小胶质细胞的激活以及大量炎性因子聚集增加的征象［11］。因此，抑制小胶质细胞释放的炎性介质将有助于减缓与炎症相关的神经系统疾病的发生和发展。本研究发现化风丹能够抑制小胶质细胞内NO、TNFα和 IL－1β炎性因子的释放。这一结果与本课题组在原代神经元－胶质细胞共培养体系中发现化风丹通过抑制小胶质细胞激活以及释放神经炎性因子从而对多巴胺能神经元产生保护作用相符［12］。

总之，本研究发现化风丹能够抑制LPS诱导的神经炎症反应，此抑制作用与减少小胶质细胞内炎症因子的释放密切相关。通过本研究拓展了化风丹的作用机理，为化风丹的临床应用提供了基础药理学依据。

［1］Nimmo A J，Vink R．Recent patents in CNS drug discovery:the management of inflammation in the central nervous system［J］．Recent Pat CNS Drug Discov，2009，4(2):86－95．

［2］Block M L，Zecca L，Hong J S．Microglia－mediated neurotoxicity:uncovering the molecular mechanisms［J］．Nat Rev Neurosci，2007，8(1):57 －69．

［3］陆远富，时京珍，石京山，等．科学评价含雄黄、朱砂中成药的安全性［J］．中国中药杂志，2011，12(24):1723－1725．

［4］Gao H M，Hong J S，Zhang W，et al．Distinct role for microglia in rotenone－induced degeneration of dopaminergic neurons［J］．J Neurosci，2002，22(4):782－790．

［5］Zhang F，Sun A S，Yu L M，et al．Effects of isorhyn －chophylline on angiotensin II－induced proliferation in rat vascular smooth muscle cells［J］．J Pharm Pharmacol，2008，60(12):1673－1678．

［6］Liu J，Xie Y，Ward J M，et al．Toxicogenomic analysis of aberrant gene expression in liver tumors and nontumorous livers of adult mice exposed in utero to inorganic arsenic［J］．Toxicol Sci，2004，77(2):249 －257．

［7］Qin L，Liu Y，Wang T，et al．NADPH oxidase mediates lipopolysaccharide－induced neurotoxicity and proinflammatory gene expression in activated microglia［J］．J Biol Chem，2004，279(2):1415－1421．

［8］Gao H M，Hong J S．Why neurodegenerative diseases are progressive:uncontrolled inflammation drives disease progression［J］．Trends in immunology，2008，29(8):357－365．

［9］Ransohoff R M，Perry V H．Microglial physiology:unique stimuli，specialized responses［J］．Annu Rev Immunol，2009，27(7):119－145．

［10］Gao H M，Liu B，Zhang W，et al．Novel anti－ inflammatory therapy for Parkinson＇s disease［J］．Trends Pharmacol Sci，2003，24(8):395 －401．

［11］McGeer P L，Itagaki S，Boyes B E，et al．Reactive microglia are positive for HLA DR in the substantia nigra of Parkinson＇s and Alzheimer＇s disease brains［J］．Neurology，1988，38(8):1285 －1291．

［12］Zhang F，Lu Y，Wu Q，et al．Role of cinnabar and realgar of WSHFD in protecting against LPS－induced neurotoxicity［J］．J Ethnopharmacol，2012，139(3):822 －828．