人参总皂苷抑制钙调神经磷酸酶信号通路参与其抗血管平滑肌细胞增殖作用＊

于雪芳，黄燮南

(1．遵义医学院药理学教研室暨贵州省基础药理重点实验室，贵州 遵义 563099;2．沭阳县人民医院，江苏 宿迁 223600)

人参总皂苷(total ginsenosides，TG)是我国名贵中药材人参(Panax ginseng C．A．Meyer)的主要活性成分，具有广泛的药理活性。近年来我们实验室证实，在心血管系统方面，TG能抑制由注射野百合碱所引起的大鼠右心室肥大，且该作用与其抑制丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase，MAPK)和钙调神经磷酸酶(calcineurin，CaN)信号通路有关［1］;TG还能抑制血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)所致血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖［2］，明显减轻由球囊导管损伤所致大鼠颈动脉内膜的异常增生［3］，TG的抗 VSMC增殖效应与其抑制MAPK信号通路、促进一氧化氮生成和抗脂质过氧化等作用有关［2、3］。近年有报道表明，CaN 信号通路参与病理性血管壁重构的形成［4］，但TG的抗增殖效应是否与其抑制CaN信号通路有关目前尚不清楚。本工作拟采用培养的VSMCs为研究对象，以AngⅡ为促增殖剂，观察TG对CaN信号通路的影响。

1 材料

1．1 药品与试剂 TG购自北京天然药物研究院，从人参茎和叶中提取所得，纯度约93%，其中含人参皂苷 Rb15．26%，Rg15．20%，Re 21．60%，Rd 13．65%和其他人参皂苷类化合物。CaN引物购自宝生物工程(大连)有限公司;CaN的催化亚基CnA兔抗大鼠多克隆抗体和Actin兔抗大鼠多克隆抗体分别为 Stressgen公司(加拿大)和 Santa Cruz公司产品。

1．2 实验动物 雄性SD大鼠，体重约350 g，购自第三军医大学大坪医院实验动物中心，许可证:SCXK20020003。

2 方法

2．1 细胞培养及给药方案 取大鼠胸主动脉中层，用贴壁法培养VSMCs［2］。然后取生长状态良好的第3－11代细胞，同步化后随机分为4组:对照组，不加任何药物;模型组，加AngⅡ10－7mol/L;TG 0．05 mg/ml组，加入 AngⅡ10－7mol/L+TG 0．05 mg/mL;TG 0．1 mg/kg 组，加入 AngⅡ10－7mol/L+TG 0．1 mg/mL。

2．2 Real time RT－PCR 检测VSMCs中CaN mRNA表达 将VSMCs(106细胞/瓶)接种于50 mL无菌培养瓶中，加入药物作用48 h，然后把消化后的细胞转入离心管中以1000 rpm速度离心5 min，留细胞沉淀;加入Trizol液500μL，室温下静置5 min，再加氯仿 500 μL，振摇 15sec，在 4℃ 下以12000 rpm行第2次离心(20 min);取上清液300 μL并加入300μL异丙醇，再在4℃下以12 000 rpm离心10 min，弃上清液;在沉淀中加75%乙醇，然后在4℃下以12000 rpm再离心5 min，清洗2次，去乙醇，即得RNA。空气干燥3 min后加入0．1%DEPC水100μL溶解，并进行RNA纯化及样品纯度鉴定。两步法逆转录－聚合酶链反应如下。

首先从基因库GeneBank中查出相关引物序列，由TaKaRa生物工程公司合成相应引物见(见表1)。PCR反应体系为20μl，反应条件:第一步，95℃ ×8 min;第二步，95℃ ×15 sec，退火温度 ×1 min。循环45次。结果分析处理(相对定量法)，Ct值为统计参数依次计算下列数据:①Ct average=(Ct1+Ct2+Ct3)/3(重复管);②dCt=Ct average－中间值;③基因的表达=2^(－dCt);④相对定量=目的基因的表达/内参基因的表达。

表1 用于real time RT－PCR的引物信息

2．3 Western－blotting检测VSMC中CnA蛋白质的表达水平 将VSMCs以106细胞/瓶接种于50 mL无菌培养瓶中，经药物作用48 h后吸净培养液，用4℃的PBS洗3次，每次约5 mL，吸净PBS后加入RIPA裂解液200μL，再用细胞刮轻轻刮下裂解物，把含沉淀的液体吸入1．5 mL离心管中并置旋涡混匀器30 s，然后置于冰上10 min使细胞充分裂解。接着在4℃下以14 000 g/min的速度离心20 min，取上清液，按BCA蛋白检测试剂盒说明书测定蛋白浓度，再分装为40 ng/20μL/孔，在100℃煮沸3 min后上样。经SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移至硝酸纤维膜上，用封闭液封闭2 h，加入以一抗稀释液稀释的抗CnA多克隆抗体(1∶1 000))和 actin多克隆抗体(1∶600)，37℃轻摇2 h。先用TBST液快速洗3次，再轻摇冲洗5 min并重复3次，然后以二抗稀释液稀释HRP标记的羊抗兔IgG(1∶1 000)，先用TBS液快速洗3次，再进行3次上述的轻摇冲洗，增强化学发光法显色，用凝胶图象分析系统进行结果分析。

2．4 统计分析方法 采用SPSS 10.0软件进行统计分析;数值变量经正态性检验后，满足条件者以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用ONE－WAY ANOVA，有差异者进一步做组间的两两比较(方差齐者使用LSD法，方差不齐的使用Gunnett＇T3法);P＜0.05认为差异有统计学意义。

3 结果

3．1 TG对VSMCs中CaN mRNA表达的影响 经AngⅡ10－7mol/L处理的模型组的CaN mRNA表达，较正常对照组约升高10倍(P＜0.01)，但以TG 0．05 mg/mL 或 0．1 mg/mL 与同量 AngⅡ同时处理细胞后，则使VSMCs中的CaN mRNA表达较模型组明显降低(P＜0.05)，阳性对照药左旋精氨酸(L－arg)0．1 mg/mL也有同样作用，TG 0．01 mg/mL组的作用甚至优于阳性药L－arg组(P＜0.05)(见图1)。

图1 TG对AngⅡ所致VSMCs中CaN mRNA表达升高的影响

3．2 TG对VSMCs中CnA蛋白表达的影响 与上述CaN mRNA表达的实验结果相吻合，模型组的CnA蛋白表达明显高于对照组(P＜0.01)，而TG 0.05 mg/mL组和0．1 mg/mL组的CnA蛋白表达较模型组明显降低(P＜0.01)(见图2)。

图2 TG对AngⅡ所致VSMC中CnA(CaN的催化亚基)蛋白质表达的影响

4 讨论

血管壁重构包括血管壁的结构和功能的改变，是高血压、血管形成术后再狭窄和动脉粥样硬化等疾病的主要特征［5］，引起重构的刺激包括血压的变化、炎症反应、细胞外基质成分的改变和血管损伤等，这些刺激使血管固有的中层VSMCs激活，并通过促进VSMC的增殖、迁移和血管基质的改变等多种过程，导致血管重构［6］。经皮腔内血管形成术后引起的血管再狭窄是这一病理状态的常见例子。我们原先的报道表明，TG能明显抑制球囊损伤所致大鼠颈动脉内膜的增生［3］，提示TG具有一定的抗血管重构作用。新近有人发现，CaN信号通路参与病理性血管重构的调节［4］。因此，有必要阐明TG的抗血管重构作用是否与其对CaN通路的抑制有关。

近年的研究表明，神经肽catestatin通过激活CaN信号通路而促进VSMC的增殖［7］，一氧化氮/蛋白激酶G(NO/PKG)系统也通过调节CaN的活性而部分地参与其VSMC增殖的抑制［8］。我们先前曾报道，AngⅡ10－7mol/L能引起 VSMCs的明显增殖［2］，而本次实验的结果表明，该浓度的AngⅡ能使VSMC中的CaN表达在mRNA水平上升高约10陪，其催化亚基CnA的蛋白质水平也有显著增高，提示AngⅡ促VSMC增殖作用也可能需要CaN信号通路的激活。更值得注意的是，TG 0．05 mg/mL和0．1 mg/mL能明显抑制AngⅡ10－7mol/L所致VSMC的增殖［2］，而在本次实验中也显示该两浓度的TG也能显著抑制AngⅡ所引起的CaN和CnA表达的升高，该结果强烈提示，TG的抗AngⅡ所致VSMC增殖作用至少部分与其抑制CaN信号通路的表达有关。因血管重构与VSMC增殖关系十分密切，因此，TG的抗血管重构作用也可能与其抑制CaN通路的表达部分有关。

［1］Qin N，Gong Q H，Wei L W，et al．Total ginsenosides inhibit the right ventricular hypertrophy induced by monocrotaline in rats［J］．Biol．Pharm．Bull，2008，31(8):1530 －1535．

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