一氧化氮对果蔬保鲜机理的探索进展

周春丽，吕玲琴，苏虎，李玉萍

（江西科技师范学院生命科学学院，江西 南昌 330013）

长期以来，人们只知道NO是一种环境污染物,污染空气，形成酸雨，破坏臭氧层,对人类的危害引起全球的关注。而在生物活性分子一氧化氮于1987年被Palmer等用化学发光方法证实其本质是NO[1-2]后。NO受到人们高度重视，成为研究的热点。1992年被Science评为“年度明星分子”[3]。而在1998年，Furchgott、Ignarro和Murad也对NO作了相应的研究，并获得了当年的诺贝尔生理学和医学奖。NO也是植物体中普遍存在的关键信号分子，参与植物细胞的多种生理过程。其在园艺产品保鲜作用也陆续展开研究。如：Leshem和Wills[4]首次报道NO对草莓果实成熟和衰老影响和控制作用，NO与植物细胞中的脂氧合酶[5]、漆酶[6]、过氧化氢酶[7]、抗坏血酸氧化酶[8]的反应，从而影响植物细胞的成熟与衰老。

截止到2010年，气调保鲜仍然是蔬菜保鲜的主要方式，NO用于气调保鲜是近年来农产品贮藏保鲜的一个研究热点，近来，有学者用SNP（硝普钠）研究了对蒜苔和马铃薯保鲜效果的影响[9-10]，并观察其保鲜效果。但NO对果蔬类具体的作用机理，迄今还少有更系统、更完整的研究。本文将从以下几个方面概述NO对果蔬的作用机理及其研究展望。

1 NO的物理化学特性

1.1 NO的物理特性

一氧化氮是氮氧化合物，化学式NO，分子量30，氮的化合价为+2。无色气体，难溶于水。能助燃，有毒，具刺激性。根据共振理论，NO有以下几种共振形式[11]：

图1 NO的几种共振形式Fig.1 Several resonance form in nitric oxide

NO有一个处于2p-Ⅱ反键轨道的单电子，是一个自由基，得到一个电子，生成NO-；失去一个电子生成了一氧化氮正离子NO+。在标准条件下（在水中，25℃，101 kPa），它的熔点为163.6℃，沸点为151.8℃，溶解度为1.8×103mol/dm3。其他一些物理化学性质见表1[12]。

表1 一氧化氮的物理化学性质Table 1 Physichemical property of NO

1.2 NO的化学特性

NO具有强氧化性。与易燃物、有机物接触易着火燃烧。遇到氢气爆炸性化合。接触空气会散发出棕色有氧化性的烟雾。一氧化氮较不活泼，但在空气中易被氧化成二氧化氮或是三氧化二氮[13]。水溶液中NO的自养化是非常复杂的过程，存在两个可能的机制[14]。在机制I中ONOO是反应产生的第一个中间产物，接着连续发生 四 步 化 学 反 应 分 别 生 成 ONOONO、NO2、N2O3和2NO2-。机制II是从NO的二聚化反应开始生成N2O2，接着加氧反应生成N2O4，N2O4转变为两分子NO2，NO2继续和NO发生反应生成N2O3，N2O3发生水解生成NO2-。但是水溶液中NO与O2的总反应式与气相中N2O3溶于水后的总反应式相同。NO与O2-反应生成ONOO-，其质子化产物为化学活性很强的过氧亚硝（ONOOH）。后者可与甲硫氨酸或巯甲基化合物反应产生NO2、OH-、乙烯等[15]。

2 植物体内一氧化氮的来源

2.1 内源NO的来源

2000年以后，很多实验已经在油菜、菠菜、玉米、甘蔗烟草等多种植物内中检测到NO的存在。表明植物体内至少存在3条形成NO的途径，包括一氧化氮酶（NOS）合成NO；硝酸还原酶或亚硝酸还原酶（NR/NiR）形成NO；以及非酶途径形成NO。具体形成的方式和步骤如图2[16]。

图2 内源NO的来源Fig.2 The origin of nitric oxide invegetables and fruits

2.1.1 一氧化氮酶合成NO

现今，对动物的NOS已经有了比较明确的认识，认为动物细胞中有神经NOS（nNOS）、内皮细胞NOS（eNOS）和可诱导的NOS（iNOS）等3种NOS[17]。在哺乳动物中，NO是由L-精氨酸、NADPH和氧分子通过NOS催化形成的，该反应需要辅因子四氢生物素喋呤，反应的终产物为L-瓜氨酸、NO和NADP+。自从在豆科植物中检测到类似哺乳动物类型的NOS以来，植物NOS的研究取得显著进展，先后在烟草、大豆、小麦、玉米和紫杉等植物中也发现了类似NOS的活性存在，这种活性受到动物NOS抑制剂的抑制。目前，人们已经对植物中NOS的编码基因、cDNA序列以及与动物NOS高度同源的蛋白的分离等方面展开研究。最近，烟草NOS被成功地分离鉴定，认为它是甘氨酸羧酶P蛋白的一种变体形式。这是在植物中第一次发现与哺乳动物NOS相似的酶[18]。今后更多植物内源NOS的分离鉴定及其编码基因的确认将会为植物NOS的存在和NO产生机制提供充分的证据。

2.1.2 硝酸还原酶合成一氧化氮

通过实验，已经在原核生物中发现3种不同的NR家族[19]，即NASI、NAR和NAP。其中NASI位于胞质区域[20]。而高等植物中的NR/NiR是氮代谢的关键酶。NR/NiR催化硝酸盐或亚硝酸盐和NADH或NADPH形成NO[21]，具体如图3，目前已经在向日葵、菠菜等中发现NR催化形成NO[21-22]，而硝酸还原酶催化产生NO的研究已经在完整的植株如大豆、太阳花叶片、菠菜叶片等广泛开展。

图3 植物体内由NR催化形成NO的途径[23]Fig.3 The path of formation nitric oxide by nitrate reductase catalysis in plants

2.1.3 非酶促途径

非酶促反应产生NO在植物组织中占有重要地位。大多数情况下，在酸化的区域或组织中NO多经非酶途径形成[22]。NO可以经由反硝化作用和生物固氮形成，硝化作用和反硝化作用将N2O氧化形成NO，由类胡萝卜素转化的光介导非酶反应产生NO，抗坏血酸或光参与时由NO2形成NO，NO也是植物呼吸作用的副产品，植物甚至可以感知土壤微生物产生NO。NO还可在外界胁迫条件下如除草剂处理后产生，受胁迫的植物细胞中伴随氧爆（oxidative burst）也可以迅速产生NO[17]。

一般来说，有氧条件下以来NR的途径是形成NO的主要方式，酸化区域或组织则多是非酶途径形成NO[22]。

2.2 外源NO的来源[13]

一些化学反应可以得到NO

铜和稀硝酸反应 3Cu+8HNO3=3Cu（NO3）2＋2NO＋4H2O

二氧化氮通到水中H2O+3NO2=NO+2HNO3

在空气中高压放电N2+O2=2NO

再比如KI、硫酸与KNO2三者混合反应（KNO2与NO之间的比例为1∶1）

2KNO2+2KI+2H2SO4→2NO+I2+2H2O+2K2SO4

亚硝酸和抗坏血酸（ascorbic acid ASA）等在酸性条件下反应也可以产生一氧化氮。其方程式如下：

此外，可以从释放NO的载体化合物中获得，比如硝普钠（sodium nitroprusside，SNP）和S-亚硝基-N-乙酰基霉（S－nitroso－N－acetyl－pennicillamine，SNAP）。

3 NO对果蔬的作用机理

目前NO延长绿色蔬菜保鲜保鲜期的研究主要集中在2个方面，一方面是NO的最佳处理条件，如浓度、时间等因素的研究；另一方面是NO的释放研究。关于NO延长果蔬保存期的机理也主要存在2个途径，一方面认为NO处理抑制了果蔬内源乙烯的合成，从而延缓其成熟，达到延长保鲜的效果[24]；另一方面认为NO处理使得果蔬抗氧化酶系，如超氧化物歧酶（Super oxide dismasts，SOD），过氧化物酶（Peroxidase，POD）等活性增强，提高了抗氧化能力，从而达到延长保鲜期的效果[25]。

3.1 NO抑制内源乙烯的形成

乙烯在果实成熟过程中起着重要的调节作用，这种作用是通过乙烯生成量的增加和组织对乙烯敏感性的改变而实现的。

ACO也是植物衰老过程中乙烯生物合成的一个关键酶。近年来研究发现，NO作为一种生物活性小分子，可以有效的抑制植物组织中ACS和ACO的活性[24-27]，见图4，从而显著抑制了乙烯的生物合成。从而延缓绿色蔬菜的衰老。

图4 NO和过氧化硝酸的乙烯合成调控模型Fig.4 Proposed mode of NO and peroxynit rite down regulation of ethylence

植物体内乙烯受体是乙烯生物合成和信号转导途径中的一个关键信号因子，可以感知乙烯的作用，并诱导ACO基因的表达，表现为外源乙烯处理后蔬果的ACO活性迅速升高和乙烯生成量的增加。NO还可以通过调控ACC合成酶及ACC氧化酶而抑制乙烯的合成[28]。Leshem和Haramaty[29]用KNO3等反应产生的NO熏蒸豌豆叶片，并在部分处理的溶液中加入乙烯前体物质ACC，2 h后发现无论施用ACC与否，NO与乙烯均同时释放，在未以ACC处理的实验中，乙烯和NO释放均下降，但NO释放量多于乙烯。低浓度NO促进豌豆叶片的伸展，高浓度则有使其缩小的趋势，将叶片直接置于纯NO中时出现明显生长下降趋势。于此，可以推断出，乙烯浓度的变化对蔬果成熟与衰老有很大的影响。

Leshem等[30]采用N－叔丁基－α－苯基硝酮（PBN）和3－吗啉－斯德酮亚胺（3－morpholinosydnonimine，SIN－1）等所释放的一定浓度的外源NO来处理鳄梨、香蕉、樱桃、番茄、猕猴桃、柿和甜橙后，发现未成熟果实产生的内源NO量均显著高于成熟的果实，鳄梨和香蕉的未成熟组织中NO含量分别是其成熟果实的约10倍和4倍，证明外源NO均可延迟其成熟衰老。外源乙烯可以促进内源乙烯的生成，而NO可以抑制外源乙烯对内源乙烯的作用，从而达到抑制绿色蔬菜成熟与衰老。2007年，刘孟臣等证实了NO显著抑制了果实内源乙烯的生物合成，并且NO处理可以显著抑制外源乙烯所引起的果实中乙烯的生物合成[31]。2009年刘国华等，已经验证了NO可能作为H2O2、Ca2+对介导信号来诱导气孔的关闭，调节乙烯的浓度，从而延缓蔬果的衰老，达到保鲜效果[32-33]。具体蔬果内的NO是怎样起作用的，见图5。

图5 植物体内NO作用途径Fig.5 The path nitric oxide action in plants

图5是参照Leshem[34]和张文利[35]，并略有改动。ACC：1-氨基环丙烷-1-羧酸，ACO：顺乌头酸酶，ACS：ACC合成酶，ADPRC：ADP-核糖环化酶，Ap：抗坏血酸过氧化物酶，cADPR：环式ADP-核糖，CAR：类胡萝卜素，CAT：过氧化氢酶，CHS：苯基苯乙烯酮合成酶，COX：细胞色素氧化酶，FR：自由基，cGC：鸟苷酸环化酶，GST：谷胱苷肽硫转移酶，IRP：铁调节蛋白，NOS：-氧化氮合酶，NR：硝酸还原酶，PAL：苯丙氨酸解氨酶。PR.1：病程相关蛋白-1，SA：水杨酸，SAM：S一腺苷甲硫氨酸，SIPK：水杨酸诱导蛋白激酶，cGMP：环鸟苷单磷酸，（＋）：促进作用，（-）：抑制作用，（…）：尚需确定的步骤。

3.2 NO与自由基和各酶对延缓蔬果的成熟与衰老的机理

衰老自由基学说认为，自由基产生与清除的平衡对维持生物体正常物质代谢起作用，衰老是自由基过度氧化的过程，任何降低自由基过度氧化的措施都可以延缓衰老。NO可能通过调节植物体内抗氧化酶的活性调节ROS含量。已有研究表明NO可通过影响植物体内的抗氧化酶体系影响活性氧含量，从而调控植物体的衰老进程。

NO对生物体有双重作用。一方面，低浓度NO能迅速清除超氧阴离子（O2－）和脂质自由基（R－），阻断包括脂质过氧化在内的ROS参与的各种伤害反应，诱导抗氧化酶基因的表达，起保护作用[36-37]。另一方面，高浓度NO与O2-相互作用生成大量的过氧亚硝酸阴离子（ONOO-），后者质子化形成强氧化性的过氧亚硝酸ONOOH，破坏生物大分子的结构与功能，最终具有生物毒性[36]。Lurie S等研究表明，蔬果在采收后H2O2的活性氧代谢加强，对细胞产生毒害，导致细胞膜结构的破坏，从而使果实软化衰老加快[38]。H2O2可氧化金属形成高价金属氧代物等强氧化剂，引起膜脂过氧化造成细胞损伤[39]。H2O2可能通过两个途径来减缓这种伤害：一方面，SNP释放的H2O2既能直接与生物分子发生相互作用，又能与超氧化物或氧反应生成氮氧化合物（RONS）来间接地发生硝化作用和氧化作用等[40]，使采后草莓果实维持较高的CAT活性，通过增强CAT活性来消除H2O2引起的膜功能和结构的破坏，使之能更好地维持细胞内膜系统的区域化作用和膜结构的完整。另一方面，植物组织膜脂过氧化作用的启动需要LOX[41]，SNP处理明显地抑制了LOX酶活性，其原因可能是NO与在LOX活性位点上的非血红素离子发生化学反应，把这种高价化合物还原到低价状态，改变了LOX酶的部分立体结构[42]，导致LOX酶的活性降低，延迟脂质过氧化作用的启动，保护膜结构的完整，延缓果实软化。2005年朱树华等在NO对草莓果实衰老的影响中，证明了NO可以抑制纤维素酶和LOX活性，提高CAT活性，表现出延缓草莓果实软化衰老的生理作用[7]。2009年，朱先波等用NO处理了马铃薯，并得出NO可以显著降低马铃薯的失重率、腐烂率和萌芽率；延缓VC含量和可溶性固形物含量的下降；抑制还原糖的生成；提高了SOD酶的活性，显著降低了乙烯释放速率、呼吸强度、淀粉酶活性和PPO的活性。研究说明NO处理可以改善马铃薯的贮藏品质[10]。

由此，可以推断出NO的处理影响果实内自由基、CAT、SOD、POD、LOX等酶的活性，从而延缓果蔬的成熟与衰老，但其具体的作用机理，还有待进一步的研究。

4 研究展望

当前，果蔬产品贮藏保鲜中常用低温贮藏保鲜技术和气调贮藏保鲜技术。低温贮藏保鲜是以控制温度为条件来抑制果蔬生理活性、抑制微生物的繁殖，其缺点是在贮藏中果蔬尚存在部分微生物继续活动，并发生萎缩现象。气调贮藏是较先进的果蔬保鲜法，发展较快，可以延缓果蔬衰老，减少乙烯对果蔬的刺激，降低腐烂率等，成为正在兴起的研究热潮。

NO广泛存在于生物体中，不仅影响着物的生长发育等一系列生理过程，而且在信号转导过程中担任关键角色。适宜浓度NO处理具有效果明显、省时省力、节约成本等优点。因此，研究NO在果蔬产品贮藏保鲜中的应用技术有一定的理论和实际意义，开发潜力很大，值得深入探讨。

今后可考虑从以下几个方面深入研究：

1）对果蔬保鲜方面的机理进一步研究，并捕获NO调控过程中保鲜基因表达水平与蔬菜保鲜效果之间的联系。

2）调控内源NO代谢过程中含量变化进行产品保鲜的技术措施以及以NO保鲜不同园艺产品条件的优化和技术体系的构建。

3）NO参与成熟衰老过程中的乙烯调控及其信号转导过程，以及通过控制乙烯来延缓果蔬成熟与衰老的作用机理。

4）调控内源NO的含量代谢途径和具体的作用机理。

5）NO通过对果蔬体内各种酶的作用机理，来延缓果蔬的衰老。

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