酵母天然自溶促进剂筛选

王东明，应俊辉，孔秋燕，王燕飞，林思思

（丽水职业技术学院环境工程分院，浙江 丽水 323000）

目前生产酵母抽提物的方法主要有自溶法、酶分解法和酸分解法等3种，欧美及我国所生产的酵母抽提物绝大部分都是采用这种方法。自溶促进剂可以加速酵母的自溶，缩短自溶时间，自溶促进剂包含有：食盐、乙醇、甲苯、乙酸、乙醇、半胱氨酸、吡哆醇、硫胺素、碳原子数为4～14的脂肪酸及其甘油脂、氨基乙醇、EDTA等，其中研究最早且最多的是食盐和乙醇，但这2种物质一般加量较大时才能有明显的促进作用，这样在生产过程中会造成一些负面影响，如食盐含量很高，因而须进行脱盐处理，而当乙醇加量过高时，也会不利于反应的进行[1]。我国有丰富的啤酒酵母资源，以其生产酵母抽提物不仅合理地利用了啤酒厂的下脚料，具有显著的经济、社会、环保效益[2]。本研究筛选天然抗酵母物质，开发酵母天然自溶促进剂，为工业化生产酵母抽提物提供安全无毒天然促进剂，并能改善抽提物营养价值和风味。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植物材料

黄芩、七叶一枝花、苍耳子、栀子，黄柏、大麻仁、桑叶、板蓝根、薏仁、茯苓、蒲公英、半边莲、杏仁、金银花、桔梗、夏枯草、紫花地丁、八角茴香、冬瓜仁、香薷、决明子，田基黄、大青叶、防己、白花蛇王草、小春花、千里光、苍耳、秦皮、黄连、牛蒡子、陈皮、大黄、党参、甘草、吴茱萸、槐米，从丽水市百姓大药房购买。

1.1.2 菌种

安琪高活性酵母菌。

1.1.3 试剂

茚三酮、亮氨酸、抗坏血酸、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G250、美蓝等。

1.1.4 培养基

马铃薯固体培养基、马铃薯液体培养基[3]。

2 方法

2.1 抗酵母物质筛选

1）植物材料洗净后，80℃烘干，碾碎，称取样品5 g～6 g于锥形瓶中，加入乙醇20 mL～30 mL，浸泡24 h，过滤后，浓缩至浸膏状[4]。

2）吸取200μL酵母菌菌悬液于马铃薯固体培养基平板上，用三角涂棒涂匀。将无菌滤纸片（直径1 cm）蘸取植物提取液浓缩浸膏平铺在含菌平板中，每个平板放置4块滤纸片[3]。

2.2 抗菌物质促酵母自溶效果

1）称七叶一枝花、桔梗、牛蒡子、八角茴香、秦皮各10 g，分别放入150 mL三角瓶，加水20 mL，封口膜密封，80℃下水浴5 h，过滤，制备中药材水提液，放入冰箱低温保藏备用。

2）称取酵母5 g加入150 mL三角瓶，分别加入七叶一枝花、桔梗、牛蒡子、八角茴香、秦皮水提液1 mL，以不加药液做对照，调节至pH7.0，定容到50 mL，封口膜密封，50℃下水浴24 h，过滤，美蓝染色，镜检观察酵母细胞[3]。取滤液测定可溶性蛋白、游离氨基酸含量。

3）称取酵母5 g加入150 mL三角瓶，分别加入桔梗、八角茴香水提液0.5、1、0.5、1.5、2、2.5 mL，方法同1.2.2中2）。

4）考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白含量，茚三酮法测定游离氨基酸含量[5]。

2 结果与分析

2.1 抗酵母物质筛选

抗酵母物质筛选如图1。

30多种植物材料中，桔梗、八角茴香、七叶一枝花、大黄、牛蒡子、秦皮6种对酵母菌具有抗菌效果，其中以七叶一枝花、桔梗的抗菌效果最明显，说明从天然植物材料中比较容易筛选出抗酵母菌物质。桔梗嫩茎叶和根均可供蔬食，盛产于我国东北部地区，是朝鲜族的特色菜；八角茴香是属于既是药品又是食品的品种；牛蒡子属于卫生部批准可用于保健食品的物品[6]，大黄有一定致泻作用；桔梗、八角茴香、牛蒡子等适合做酵母天然自溶促进剂。

图1 不同抗菌植物材料抑菌效果Fig.1 Antibacterial effect of different plant materials

黄芩、槐米、香薷、紫花地丁等主要含黄酮类化合物，吴茱萸、小春花、半边莲、大麻仁、黄柏、防己、黄连等主要含生物碱，金银花、蒲公英主要含有机酸，上述植物材料所含的活性成分对酵母菌不具有抗菌效果；陈皮、杏仁、八角茴香主要含有挥发油，牛蒡子主要含木脂素，秦皮主要含香豆素，大黄、决明子主要含蒽醌类化合物，茯苓、夏枯草、七叶一枝花、田基黄、栀子、党参、甘草、苍耳子、桔梗、苍耳、千里光等主要含萜类化合物，由于植物材料中活性成分种类多样性，同一类成分中某几种结构类型才有抗菌效果，需要进一步深入研究，才能精确定位到是那类结构类型化合物产生抑菌作用。

2.2 抗菌植物材料促自溶效果分析

抗菌植物材料促自溶效果分析如图2。

图2 不同抗菌植物材料促进酵母自溶效果Fig.2 Effect of accelerating yeast autolysis of different plant Materials

酵母细胞50℃下水浴24 h，美蓝染色，镜检观察，在有无抗菌物质的情况下，菌体细胞呈蓝色，说明酵母细胞衰退或死亡。酵母属于中温性菌，50℃下水浴，酵母得不到充足氧气和养分，蛋白质变性等，菌体正常代谢被破坏。可溶性蛋白是由菌体渗透出来的水溶性蛋白，测定可溶性蛋白可反映出菌体蛋白降解及菌体自溶状况。加入抗菌物质后，可溶性蛋白含量明显提高，说明抗菌物质能作用于菌体代谢系统，促进菌体蛋白降解为水溶性蛋白，并提高菌体破坏细胞结构相关酶的活性，造成菌体结构破坏，渗透性增强，其中以加入桔梗的效果最明显，秦皮效果最小；游离氨基氮含量反映酵母菌体的内源性蛋白酶将菌体蛋白质完全水解成氨基酸而溶解出菌体外的过程，酵母水浴液中加入七叶一枝花，游离氨基氮含量明显下降；加入其他抗菌物质后，游离氨基氮含量均在0.03 mg/mL左右水平，仅八角茴香能略微提高游离氨基氮含量，说明抗菌物质对将蛋白质完全水解成氨基酸的相关蛋白酶活性作用小，七叶一枝花尚有一定抑制作用。

桔梗提高可溶性蛋白含量最明显，八角茴香能略微提高游离氨基氮含量，两者药食兼用，适合作为酵母天然自溶促进剂。乙醇浓缩液以七叶一枝花抗菌效果最明显，水提液以桔梗和八角茴香促自溶效果理想，平板抑菌试验中抗菌物质作用于增殖状态的菌体，水浴液中抗菌物质作用静止状态的菌体，抗性上有一定差异；抗菌物质抗菌性能变化与抗菌物质溶解度也有一定关系，乙醇溶解范围广，能溶解亲脂性成分和亲水溶性成分，七叶一枝花中抗菌活性成分可能主要为极性小的成分。酵母自溶法是在水中进行，应提高天然抗性物质在水中的溶解度或选择水溶性大的物质。

2.3 桔梗和八角茴香促自溶效果分析

桔梗和八角茴香促自溶效果分析如图3。

酵母水浴液中加入八角茴香，可溶性蛋白含量随着八角茴香水提液用量增加而增加，当八角茴香水提液大于1.5 mL，可溶性蛋白含量下降，说明八角茴香用量少时，能提高将蛋白质部分水解的相关蛋白酶活性，提高菌体破坏细胞结构相关酶的活性，当八角茴香用量大时，又会产生一定抑制作用。八角茴香水提液对游离氨基氮含量影响不大，说明八角茴香对将蛋白质完全水解成氨基酸的相关蛋白酶活性影响小。

桔梗水提液提高可溶性蛋白含量，但不随桔梗使用量而发生改变，说明桔梗的活性成分对菌体部分水解蛋白酶活性及细胞结构破坏相关酶活性的激活作用达到饱和。桔梗用量超过2 mL，游离氨基氮含量下降，说明桔梗用量大时会对将蛋白质完全水解成氨基酸的相关蛋白酶产生抑制作用。

图3 桔梗和八角茴香促自溶效果Fig.3 Effect of accelerating yeast autolysis of Radix Platycodonis,Illicium verum

3 结论

30多种植物材料中，桔梗、八角茴香、七叶一枝花、大黄、牛蒡子、秦皮6种对酵母菌具有抗菌效果，酵母50℃水浴液中加入抗菌物质，可溶性蛋白含量含量增加，说明抗菌物质促进菌体蛋白降解为水溶性蛋白，并对酵母细胞结构有一定的破坏作用，能促进酵母自溶，适合作为酵母天然自溶促进剂，但对将蛋白质完全水解成氨基酸的相关蛋白酶作用小，七叶一枝花还有一定抑制作用。桔梗、八角茴香药食兼用，作为酵母天然自溶促进剂，还具有改善风味和营养价值作用，如果应用于工业化生产，许多细节问题有待进一步研究。

[1]郭永,庞宏建.酵母抽提物的研究进展[J].中国调味品,2010(12):24-28

[2]秦楠,缪文玉.酵母抽提物生产工艺及其应用现状[J].农产品加工,2009(12):27-29

[3]沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验[M].北京:高等教育出版社,1999：42,100-102,215

[4]董小萍.中药品种与化学成分实验[M].上海:上海科学技术出版社,2003:168-173

[5]刘永军,郭守华,杨晓玲.植物生理生化实验[M].北京:中国农业科技出版社，2002:64-66,81-82

[6]卫生部.卫生部关于进一步规范保健食品原料管理的通知[EB/OL].（2002-02-28） http://www.moh.gov.cn/publicfiles/business/htmlfiles/mohwsjdjdJ/s3593/200810/38057.htm