响应面法优化木瓜果实中齐墩果酸提取工艺

孟祥敏，殷金莲

（大兴安岭职业学院，黑龙江 加格达奇 165000）

木瓜，属蔷薇科木瓜属植物，为多年生落叶灌木或小乔木，是集食用、药用、观赏于一体的多用途植物。中医认为木瓜有“舒筋活络、健脾开胃、舒肝止痛”的药理作用[1]。现代研究表明,木瓜富含多种氨基酸及营养元素，并含有黄酮、SOD、齐墩果酸等多种活性物质[2-3]。木瓜的主要药效成分为齐墩果酸，据文献报道，齐墩果酸具有消炎抑菌、降低转氨酶的作用，还可以促进肝细胞再生、防止肝硬化、降血脂、降血糖、增强机体免疫功能、抑制变态反应等，是当前治疗肝炎的有效药物之一[4-6]。

近年来，人们对木瓜果实中齐墩果酸进行研究，但超声波法提取齐墩果酸的报导较少。为此，本文利用超声波法提取木瓜果实中的齐墩果酸，并利用响应面法对提取参数进行优化，对指导生产具有积极的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

木瓜干：陕西省白河县提供；齐墩果酸对照品（98%）：陕西慧科植物开发有限公司。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器

DFT-50型小型万能破碎机、101-0型电热恒温鼓风干燥箱、RE-52AA型旋转蒸发仪：上海比朗仪器有限公司；KQ-600DB型超声清洗器：昆山市超声仪器有限公司；SHB-Ⅲ型循环水式真空泵：郑州长城科工贸有限公司；LC-20A型高效液相色谱仪：日本岛津公司；JA2003A型精密电子天平：上海达平仪器有限公司；HH-S1型恒温水浴锅：金坛市瑞华仪器有限公司等。

1.2.2 试剂

无水乙醇（分析纯）、冰醋酸（分析纯）、三乙胺（分析纯）、甲醇（分析纯）、甲醇（色谱纯）等。

2 方法

2.1 木瓜中齐墩果酸的提取方法

将木瓜干粉碎，过30目筛。称取木瓜粉1 g，加入50 mL无水乙醇，在不同条件下超声波提取，抽滤，将滤液浓缩蒸干。用甲醇溶解浓缩物并转移到10 mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀得样品液。

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇浓度的确定。

称取木瓜粉5份，每份1 g，分别加入50 mL 30%、50%、70%、90%乙醇和无水乙醇，在30℃下超声波提取40min，抽滤，将滤液浓缩蒸干。用甲醇溶解浓缩物并转移到10 mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀得样品液。将样品液用0.45μm微孔滤膜过滤，取20μL进样分析。测得齐墩果酸含量与乙醇浓度的关系。

2.2.2 料液比的选择[4]。

称取木瓜粉5份，每份1 g，分别按料液比1∶50、1∶40、1∶30、1∶20和1∶10选取浸提溶剂的体积，在30 ℃下以无水乙醇超声波提取40 min，抽滤，将滤液浓缩蒸干，以下操作同2.2.1，测得齐墩果酸含量与料液比的关系。

2.2.3 提取时间的选择[5]。

称取木瓜粉5份，每份1 g，加入50 mL无水乙醇，在30 ℃下超声波分别提取20、30、40、50、60 min，抽滤，将滤液浓缩蒸干，以下操作同2.2.1，测得齐墩果酸含量与提取时间的关系。

2.2.4 温度因素的选择[5]。

称取木瓜粉5份，每份1 g，加入50 mL无水乙醇，分别在30、40、50、60、70 ℃以无水乙醇超声提取40 min，抽滤，将滤液浓缩蒸干，以下操作同2.2.1，测得齐墩果酸含量与提取温度的关系。

2.3 超声波提取工艺的优化（Box-Behnken设计）

利用超声波法提取木瓜中齐墩果酸的过程中,提取率的高低受多种因素的影响。根据本试验前期的研究表明，提取溶剂的种类、浓度、提取温度、超声时间、料液比都会对提取率有一定程度的影响。经比较，无水乙醇和甲醇较氯仿、丙酮提取率偏高，同时考虑到甲醇有毒，试验选用无水乙醇作为提取溶剂。超声波功率对齐墩果酸提取率影响不大，试验中确定功率为600 W。在此基础上，试验应用相应面法中的Box-Behnken设计对提取温度、料液比、超声时间3个因素进行优化。试验设计借助Design Expert软件，因素的水平及编码如表1[7]。

表1 Box-Behnken设计试验因素水平及编码Table 1 Box-Behnken design experimental factor and coding

2.4 齐墩果酸的含量测定

2.4.1 色谱条件

Agilent 1100高效液相色谱仪；UV-2075紫外可见检测器；HiQ Sil C18（4.6 mm×250 mm）色谱柱；流动相为甲醇∶水∶冰醋酸∶三乙胺（89∶11∶0.04∶0.02），流速：0.8 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：210 nm；进样量：20μL。

2.4.2 线性关系考察

精密称取齐墩果酸标准品适量，加入甲醇制成浓度为0.50 mg/mL的齐墩果酸标准液。将标准液浓度依次稀释为0.25、0.1、0.05、0.025 mg/mL。将以上溶液经0.45μm微孔滤膜过滤,在2.4.1色谱条件下进样分析，测定峰面积。以齐墩果酸浓度为横坐标（X），各浓度对应的峰面积（Y）为纵坐标作标准曲线，其回归方程为：Y=2.306192e-007X，R2=0.99981。齐墩果酸的浓度在0.025 mg/mL～0.5 mg/mL范围内与峰面积成良好的线性关系。

2.4.3 精密度、重现性及加样回收率试验

对标准品溶液重复进样5次，每次20μL，齐墩果酸峰面积的RSD为0.25%。取样品5份，按样品液方法制备，在2.4.1色谱条件下进样分析，根据峰面积计算出齐墩果酸的RSD为1.34%。称取已测得齐墩果酸含量的木瓜粉末3份，每份1 g，3份分别加入齐墩果酸标准品5.0、10.0、15.0 mg，按样品液方法制备后测定含量，结果齐墩果酸平均加样回收率为98.2%。说明在样品处理过程中齐墩果酸损失量少、重现性好，仪器精密度高，方法可行。

2.4.4 样品液的测定

将2.1中样品液用0.45μm微孔滤膜过滤，在上述色谱条件下取20μL进样。根据标准曲线，用外标法对木瓜中齐墩果酸的含量进行定量分析。

3 结果与分析

3.1 响应面数值分析结果

Box-Behnken设计方案及所得试验结果如表2。其中A，B，C分别对应提取温度、料液比和超声时间的因素水平值，响应值为对应提取条件下齐墩果酸的含量。

表2 Box-Behnken设计及试验结果Table 2 Box-Behnken design and experiment result

利用Design-Expert软件，对上表数据进行二次多项拟合，得到齐墩果酸提取率与提取温度、料液比、超声时间三因素之间的三元非线性回归方程:

式中：Y为齐墩果酸含量；A，B，C分别为上述三因素的编码值。

3.2 回归方程各项的方差分析结果

回归方程各项的方差分析结果，如表3。

表3 回归方程方差分析表Table 3 Regression equation analysis of variance table

从方程的方差分析表3可以看出，试验所选用模型显著（P<0.05）,拟合度好。方程的回归系数显著性检验表明，因素B和C对齐墩果酸含量的线性效应显著，BC对齐墩果酸含量的交互效应影响显著，其余因素影响不显著，具体见表4。

表4 回归方程系数显著性检验Table 4 Regression equation significance test

3.3 等高线图和响应面图分析结果

通过回归方程所做的等高线与其对应的响应面图见图1，比较3图可知：料液比、超声时间对齐墩果酸提取率的影响较为显著，表现为曲线较陡，其最佳值分别在1∶16和45 min左右。而提取温度对齐墩果酸提取率的影响不大，表现为曲线较为平滑，随其含量的增加或减少，响应值变化很小，其最佳值约为53℃。

图1 等高线与其对应的响应面图Fig.1 Contour line and response surfaces

综合响应面数值与等高线图分析，在点（0.31307，0.36616，0.53066）处响应值有最大值，也就是说用无水乙醇作溶剂，在温度为53.13℃、料液比为1∶16.83、提取时间为45.31 min时，齐墩果酸提取率最高。为方便操作，选择温度53 ℃，料液比为1∶16，时间为45 min，在此条件下重复操作3次，齐墩果酸平均提取率达到1.40 mg/g，也说明了试验设计方法的科学合理性。

4 结论与讨论

1）目前齐墩果酸含量测定的方法多用比色法、薄层色谱扫描法[8-9]，本文用高效液相色谱法测定木瓜果实中的齐墩果酸，方法操作简单、灵敏、重现性好，可以用来对木瓜药材中齐墩果酸的含量进行测定。试验过程中对比了不同的流动相：甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水、甲醇-0.5%醋酸铵、甲醇∶水∶冰醋酸∶三乙胺溶液[10]等多种流动相体系，结果发现以甲醇∶水∶冰醋酸∶三乙胺（89∶11∶0.04∶0.02）作流动相，同时控制流速0.8 mL/min、柱温30℃、检测波长210 nm、进样量20μL，齐墩果酸与其它峰的分离度较高，可得到满意的色谱图。

2）响应面法需要的试验次数少、周期短，求得的回归方程精度高,并且它能同时研究几种因素间的交互作用。经响应面法优化得出，木瓜中齐墩果酸的最佳超声提取条件为：温度为53℃，料液比为1∶16，提取时间为45 min。通过验证试验，在此条件下齐墩果酸的提取率达到1.40 mg/g。

3）试验结果表明，木瓜果实中含有生理活性物质—齐墩果酸，含量达0.14%。我国木瓜资源丰富，因此可以对木瓜果实中的齐墩果酸进行提取分离，开发生产具有保健功能的食品、药品，以满足市场需求，同时也可为生产企业和地方发展带来较好的经济效益和社会效益。

[1]唐春红,叶志义,项昭保,等.木瓜营养保健作用研究动态[J].天然产物研究与开发，2000,12(4):97-100

[2]周帼萍,汪芳安,高冰.木瓜醋的研制[J].中国酿造，2005,144(3):56-58

[3]项昭保,任绍光,石轶松.木瓜资源的开发与利用[J].中国野生资源,2002,21(5):26-27

[4]周志勇,袁丁.齐墩果酸药理作用研究进展[J].中国医院药学杂志,2008,28(23):54

[5]Ovesna Z V, Achalkova A. Pentac_yclic triterpenoic acids: new chemoprotective com-pounds minireview[J]. Neoplasma,2004,51(5):327

[6]董海丽,陈怡平.超高压提取木瓜中齐墩果酸的研究[J].食品与发酵工业,2007,33(11):125-127

[7]冯涛,曹东旭,高辉,等.利用响应面法确定竹叶中黄酮最佳提取条件[J].天津轻工业学院学报,2003,18(2):9-14

[8]都述虎,饶金华,耿武松,等.薄层扫描法测定木瓜中齐墩果酸的含量[J].中草药,2003,34(1)：35-37

[9]吴波,张寒俊.高效液相色谱法测定食品中齐墩果酸的含量[J].食品科学,2005,26(12):176-178

[10]相延英,杨光.常用中药中齐墩果酸和熊果酸的含量测定[J].中国医院药学杂志，2004,24(5):316-318