酸马奶分离到的乳酸菌分子鉴定

金山，白雅莉，赵洪鑫，芒来

（1.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.内蒙古科技信息研究所，内蒙古 呼和浩特 010010；3.内蒙古双奇药业股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 010010；4.内蒙古农业大学，内蒙古 呼和浩特 010018）

蒙医药典中记载：“酸马奶味酸、甘、涩。”酸能开胃、助消化、祛湿、行气，甘能健身补弱、疏通食道、治伤、接骨、解毒、增强五官功能，涩能治血热、化淤血、消肥胖、祛腐生肌、润皮肤[1]。在现代研究中发现，酸马奶具有降血脂[2]、降胆固醇[3]、降血压、治疗便秘、抑制结核菌生长、贫血和改善糖尿病等功效。为了研究这些功效产生的因素，中外学者分别对酸马奶的成分、微生物群组成、酸度、蛋白质成分、微量元素组成等进行了详尽的研究。根据酸马奶拥有马奶所不具备的功效，而其成分最大的不同是由酸马奶中微生物群体造成的；酸马奶中微生物群的构成成为了研究重点，已经得出的研究成果中，其结论各不相同，大体上以酵母菌菌群和乳酸菌菌群为主。本实验研究的重点为酸马奶中的乳酸菌。

国内外许多学者对酸马奶中的微生物进行了研究，其分离结果均不相同。日本学者Ishii等从中国内蒙古的酸马奶样品中分离到了包括乳酸杆菌Lb.paracasei subsp.paracasei亚种、Lb.rhamnosus和Lb.curvalus等乳酸菌及乳酒假丝酵母和马克斯克鲁维酵母等乳糖发酵酵母[4]。贺银凤等从15份酸马奶样品中分离出乳酸杆菌Lb.casei subsp.casei、Lb.sanfranciso、Lb homohiochii、Lb.sharpeae、Lb.jenesenii和Lb.maltaromicus，球菌Lc.mesenteroedes subsp.dextranium、E.faecalis、Laccoccus lactis、Streptococcus、E.durand等，以及酵母菌共53株[5]。Ying AN等对分离自中国内蒙古酸马奶中的乳酸菌进行了研究，认为以L.plantarum和L.pentosus为主[6]。李少英等从内蒙古锡林郭勒盟的酸马奶样品中分离到乳酸杆菌L.acidophilus和L.casei共12株[7]。石井等从蒙古国酸马奶中分离到的乳酸杆菌以L.plantarum为优势菌[8]。Burentegusi等从内蒙古酸马奶样品中也分离到L.paracasei subsp.paracasei、L.coryniformis subsp.coryni formis、L.curvatus、L.kefiranofaciens等同型发酵乳酸菌[9-10]。孙天松等从新疆地区传统发酵酸马奶中分离得到152株菌株，分别为：Lactobacillus helveticus（占总分离株的51.3%），其次为L.acidophilus（18.4%）和L.casei subsp.pseudoplantarum（8.6%），以及L.gasseri、L.casei subsp.casei、L.curvatus、L.sanf rancisco、L.coryniformis subsp.coryniformis、L.brevis、L.plantrum、L.homohiechill、L.fermentum、L.dellbrueckii subsp.bulgaricu、L.ruminis、L.crispatus、L.farciminis和L.hilgardii等数量较少（1株～4株）的菌株[11]。

酸马奶中的微生物类群比较复杂，在不同地区、不同家庭中以传统方法制作的酸马奶中微生物成分不同。酸马奶所具有的医疗保健作用与其所含有的微生物菌群有着密切的关系。因此，在本实验的研究过程中，仍然需要继续进行酸马奶中乳酸菌的分离与鉴定。由于分子鉴定比较快捷和准确，逐渐成为鉴定菌种的常用方法。本实验采用分子鉴定对从酸马奶中分离得到的11株乳酸菌进行鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料

内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗的3份酸马奶样品中分离的11株乳酸菌。由内蒙古农业大学微生物实验室提供。

1.1.2 试剂

醋酸钠、十二烷基磺酸钠（SDS）：Sigma公司分装；三氯甲烷（Chloroform）、异戊醇（Isopentanol）、无水乙醇（Ethanol）：A.R，天津化学试剂二厂；三羟甲基氨基甲烷（Tris）：Promega Corporation,USA；硼酸：北京市新光化学试剂厂；乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA·2H2O）：华美生物工程公司；Tris饱和酚：北京鼎国生物技术公司；琼脂糖（Agrose）：TAKARA分装；超级2×Taq Master Mix，是一种可以立即使用的PCR预混液，含有Taq DNA聚合酶、dNTPs、标准Taq酶反应缓冲液及染料，使用时只需要在溶液中加入模板和引物即可。混合液中含有溴酚蓝染料，PCR反应结束后可直接进行电泳：南京博尔迪生物科技有限公司。

1.1.3 仪器与设备

紫外分光光度计、高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；数码凝胶成像系统：ALPHA INNOTECH公司；电泳仪、水平电泳槽：北京六一仪器厂；9700型PCR仪：美国PERKIN ELMER公司；高速立式冷冻离心机：BECKMAN公司；220V稳流稳压电泳仪：南京大学。

1.2 方法

1.2.1 乳酸杆菌培养及基因组DNA提取

将冷冻保存的菌株接种于MRS液体培养基中，置37℃培养24 h，经MRS液体培养基培养传代3次后，取5 mL对数生长末期的具体培养物，3000 r/min离心5 min收集菌体。基因组DNA的提取方法采用CTAB法[6]，流程如图1。

图1 基因组DNA提取流程图Fig.1 The flow chart of DNA genome extracting

1.2.2 16s rDNA基因扩增

本实验所需引物选自参考文献[12]，预期目的片段长度为1500 bp左右。

P1（上游引物）：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′

P2（下游引物）：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′

本实验所建立的PCR反应体系及扩增条件如表1、2。

表1 PCR反应体系及用量Table 1 The composition and quantities of PCR

表2 PCR扩增条件Table 2 The optimized conditions of PCR

1.2.3 目的基因的纯化回收、克隆

目的基因的纯化回收采用多功能DNA纯化回收试剂盒（离心柱型）（北京百泰克生物技术有限公司）进行，克隆采用pGM-T克隆试剂盒（北京天根生物有限公司）进行。将菌液送至大连宝生物公司进行测序。

1.2.4 序列分析方法

利用BLAST，将所测定的菌株序列结果与GenBank数据库中已知菌株序列进行比对，寻找与目的基因序列同源性最高的已分类的菌种，然后提取该菌种的标准菌株序列（菌株序列名称见表3），利用软件MEGA进行序列分析，以邻域连接法（Neighber join，NJ）构建系统发育树，最终进行菌种鉴定。

表3 用于构建系统发育树的乳酸杆菌菌株Table 3 The standard strains of the NJ tree

2 结果

2.1 分子鉴定结果

2.1.1 目的基因电泳检测结果

目的基因电泳检测结果，见图2。

图2 目的基因电泳图Fig.2 The electrophoretogram of target gene

2.1.2 测序结果分析

将测序结果利用软件MEGA进行序列分析，比对结果如下。

经比对，将11株测序菌株判定为瑞士乳杆菌，与已知的瑞士乳杆菌序列（见表4）比对，其突变位点如图3。

表4 已知16 S rRNA/rDNA序列的瑞士乳杆菌菌株Table 4 The Lactobacillus helueticus strains with known 16S rRNA/rDNA sequence

将所测菌株序列与标准菌株序列进行比对，发现所测菌株中菌株17、37和51为一支，菌株4、24、29、30、39、63、64和66为一支，而且均与瑞士乳杆菌菌株的同源性较高，初步将这11株菌株判定为瑞士乳杆菌。将这11株菌株与已知的瑞士乳杆菌序列进行碱基序列分析，发现菌株之间碱基差异较大的位点为170、508、725、1220，且都为C-T之间的转换。

3 讨论

酸马奶中的微生物类群比较复杂，在不同地区、不同家庭中以传统方法制作的酸马奶中微生物成分不同。本实验所用酸马奶的酸度较高，其pH为3.8，对其中的微生物群体进行分离鉴定，得到了以瑞士乳杆菌为主的菌群。本文中，对其中的11株菌株进行了16 S rDNA同源性分析，得出：这11株菌株均为瑞士乳杆菌，且目的片段仅在个别可变位点上有区别，同源性较高。

图3 基于16 S rDNA序列建立的菌株NJ树Fig.3 The NJ tree of the strains based on the 16S rDNA sequence

图4 16 S rRNA/rDNA部分碱基序列Fig.4 The sequence of 16S rRNA/rDNA

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