均匀设计法优化罗非鱼肉富肽酶解液制备工艺

韩道财，洪鹏志，*，杨萍

（1.广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524025；2.广东省高等学校水产品深加工重点实验室，广东 湛江 524025）

均匀设计法优化罗非鱼肉富肽酶解液制备工艺

韩道财1，2，洪鹏志1，2，*，杨萍1，2

（1.广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524025；2.广东省高等学校水产品深加工重点实验室，广东 湛江 524025）

为得到高肽含量罗非鱼肉酶解液，以水解度及肽含量为指标，从胃蛋白酶、胰蛋白酶、Alcalase 2.4L、中性蛋白酶及木瓜蛋白酶中筛选出中性蛋白酶为最适用酶。在单因素试验的基础上，采用均匀设计试验优化中性蛋白酶酶解条件。得到最高肽含量酶解条件为：加酶量1.38%，料液比1∶3（g/mL），温度50℃，自然pH，时间7 h，此时肽含量（以每克鱼肉计）为（37.71±0.11）mg。

罗非鱼；酶解；均匀设计；肽含量；水解度

罗非鱼原产非洲，又名非洲鲫鱼，属鲈形目、丽鱼科、罗非鱼属。罗非鱼食性杂，繁殖能力强，味道鲜美，是联合国粮农组织向世界推荐的优良养殖鱼类之一[1]。我国是罗非鱼养殖大国，2010年产量约为120万t[2]，广东省产量约占全国的1/2。目前，罗非鱼加工产品主要是冻罗非鱼片[3]，技术含量不高、附加值低。酶解鱼蛋白可以得到生物活性肽[4-6]及具有优良吸收性的小肽[7]，罗非鱼肉酶解液具有抗氧化[8-9]、降血压[10-11]等生物活性。有研究者[12-13]以肽含量为指标对酶解罗非鱼肉进行了研究，均以三氯乙酸-双缩脲法测肽含量。本实验采用超滤-双缩脲法测定肽含量，以肽含量为主要指标，优化酶解罗非鱼肉制备高肽含量酶解液的工艺参数，以期为罗非鱼肉高值化加工与利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

罗非鱼：广东湛江霞山水产品市场，将罗非鱼去头、去鳞、去鳍、去内脏，洗净，于采肉机中采肉后-18℃冻藏；胃蛋白酶、胰蛋白酶、Alcalase2.4L：Sigma公司；中性蛋白酶、木瓜蛋白酶：南宁庞博生物有限公司；均为食品级。

水浴恒温振荡器：江苏金坛市佳美仪器有限公司；电子分析天平：日本岛津公司；CR22GⅡ高速冷冻离心机：日本日立公司；UV-8000紫外分光光度计：上海元析仪器有限公司；pHS-3C型实验室pH计：上海伟业仪器厂；5K MWCO超滤离心管：上海摩速科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酶解

在水浴恒温振荡器中酶解，酶解完成后沸水浴灭酶10 min，8000 r/min、4℃离心20 min得到上清液即为酶解液。

1.2.2 蛋白酶活力的测定

蛋白酶活力的测定采用福林法[14]。

1.2.3 水解度的测定

电位滴定法[15]测α-氨态氮含量。鱼肉总氮含量的测定采用半微量凯氏定氮法[16]。

1.2.4 肽含量的测定

用截留限为5K的超滤离心管对酶解液进行超滤，双缩脲法测定超滤透过液肽含量。采用胰岛素做标准曲线，回归方程为：y=0.0532x-0.0278（R2=0.9999）。

2 结果与讨论

2.1 酶的筛选

酶的筛选，见表1。

表 1 蛋白酶的酶解条件Table 1 Experimental conditions of proteases

选择5种蛋白酶在相同酶活力单位添加量及各自的适宜条件下（表1）酶解2 h，测得水解度及肽含量如图1所示。

由图1可知，水解度由高到低依次为中性蛋白酶>胰蛋白酶>Alcalase2.4L>木瓜蛋白酶>胃蛋白酶。肽含量由高到低依次为木瓜蛋白酶>中性蛋白酶>Alcalase2.4L>胰蛋白酶>胃蛋白酶。中性蛋白酶酶解液肽含量仅次于木瓜蛋白酶，水解度最高且价格较低，综合考虑，选择中性蛋白酶为最适用酶。

2.2 中性蛋白酶酶解条件的单因素试验

中性蛋白酶一般在pH6～7稳定，而且实际生产中调节pH难以操作，所以单因素试验中只考虑加酶量、料液比、温度和时间单因素对水解度及肽含量的影响。

2.2.1 加酶量的影响

在料液比1∶1（g/mL），温度50 ℃，自然pH条件下酶解2 h，结果如图2所示。

由图2可知，水解度随加酶量的增加而增加。当加酶量由0.4%升到0.8%时，肽含量逐渐增加，加酶量在0.8%到1.2%之间时，肽含量变化不大。这说明在其它条件一定的情况下，在一定范围内肽含量随酶浓度的增加而增加，超过一定范围时肽含量则不再增加，这或许是因为在底物的量一定时，过多的酶也不能增加肽含量的缘故。

2.2.2 料液比的影响

在加酶量1.0%，温度50℃，自然pH条件下酶解2 h，结果如图3所示。

由图3可知，水解度随料液比的增加而增加。当料液比为1∶1.5（g/mL）时，肽含量最高。料液比的增加意味着底物浓度与酶浓度的同时降低，在一定范围内，肽含量会随料液比的增加而增加，超过一定范围，肽含量则会随料液比的增加而不断下降。

2.2.3 温度的影响

在加酶量1.0%，料液比1∶1.5（g/mL），自然pH条件下酶解2 h，结果如图4所示。

由图4可知，温度为45℃时水解度最高，温度为50℃和55℃时，肽含量最高且无显著差异（p＞0.05）。温度因素对酶解过程的影响包括对酶活力的影响以及对底物的影响2个方面。对酶活力的影响方面，当温度为最适温度时，酶活性最高，低于或高于最适温度，酶活性降低甚至失活。对底物的影响方面，当温度高于一定值时，底物鱼蛋白开始变性，变性程度随温度的变化而变化。不同的变性程度意味着蛋白暴露位点的不同，同时酶解效果也不同。

2.2.4 时间的影响

在加酶量1.0%，料液比1∶1.5（g/mL），温度50 ℃，自然pH条件下进行酶解，结果如图5所示。

由图5可知，水解度随时间的增加而增加，3 h之后增速减缓，这可能是由于底物浓度降低及酶活力下降共同造成的。1 h～2 h时肽含量增加较多，2、3、5 h相差不大，5 h到7 h下降较多。说明酶解初始阶段大分子降解为小分子肽的速度大于游离氨基酸的生成速度，酶解末尾阶段则相反。

2.3 均匀设计优化酶解条件

单因素试验显示，中性蛋白酶的热稳定性较差，因此在温度50℃，自然pH条件下采用U10（108）均匀设计表[17]拟水平法进行加酶量、料液比、时间3因素5水平试验，试验方案及结果见表2。

表 2 均匀设计试验方案及试验结果Table 2 Experiment program and results of uniform design

利用JMP 7软件对均匀设计试验结果进行回归分析，得到回归方程如下：

回归方程及系数的显著性分析结果如表3所示。

表 3 回归方程及系数显著性检验Table 3 Significance test of regression equations and its

由回归方程显著性可知，两方程均显著。由回归系数显著性可知，对水解度高低的影响由大到小依次为：时间>料液比>加酶量，对肽含量高低的影响由大到小依次为：加酶量>时间>料液比，两者并不相同。

水解度预测值如图6所示。

当加酶量为1.15%，料液比为1∶3（g/mL），时间为5.53 h时，水解度最大，为19.39%。肽含量预测值如图7所示。

当加酶量为1.38%，料液比为1∶3（g/mL），时间为7 h时，肽含量最高，为37.80 mg（以每克鱼肉计）。

优化条件下分别做3次验证试验，测得水解度为（19.18±0.12）%，与预测值相差1.1%[此时肽含量（以每克鱼肉计）为24.58 mg]，测得肽含量（以每克鱼肉计）为（37.71±0.11）mg，与预测值相差0.24%（此时水解度为18.40%），两方程均预测准确。

3 结论

以水解度和肽含量为指标，对胃蛋白酶、胰蛋白酶、Alcalase 2.4L、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行筛选，选出中性蛋白酶为酶解罗非鱼肉蛋白的最适用酶。

对中性蛋白酶酶解罗非鱼肉的酶解工艺进行单因素试验和均匀设计优化试验，得到最高水解度酶解条件：加酶量1.15%，料液比1∶3（g/mL），温度50 ℃，自然pH，时间5.5 h，最高肽含量酶解条件：加酶量1.38%，料液比1∶3（g/mL），温度50 ℃，自然pH，时间7 h。验证试验证明回归方程可以较好的预测试验结果。

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Preparation of High Peptide Content Hydrolysate from Tilapia by Uniform Design

HAN Dao-cai1，2，HONG Peng－zhi1，2，*，YANG Ping1，2
（1.Food Science and Technology College，Guangdong Dong Ocean University，Zhanjiang 524025，Guangdong，China；2.Key Laboratory of Guangdong Higher Education Institutions for Advanced Processing of Aquatic Product，Zhanjiang 524025，Guangdong，China）

Neutral protease was chosen the best for obtaining high peptide content tilapia flesh hydrolysate from pepsin，trypsin，Alcalase2.4 L，neutral protease and papain，while the degree of hydrolysis and peptide content as the indicators.Based on the results of single－factor experiments，the uniform design experiment had been done to optimize the enzymatic conditions of neutral protease.The optimum conditions for peptide content were that the enzyme quantity 1.38%，the solid－liquid ratio 1∶3（g/mL），the temperature 50 ℃，the inherent pH and the time 7 h.And the peptide content was（37.71±0.11）mg（per gram fish flesh）at the optimum conditions.

tilapia；enzymatic hydrolysis；uniform design；peptide content；degree of hydrolysis

广东省粤港关键领域重点突破项目（2009A020700004）；广东省海洋渔业科技推广专项项目[A2009002-01（a）]

韩道财（1988—），男（汉），在读硕士研究生，研究方向：水产品高值化加工与利用。

*通信作者

2011-07-05