鸡梭菌性肠炎研究概论

朱良全，蒋玉文，彭 隽，孙 晔，李聪研

(1.中国兽医药品监察所，北京 100081;2.中国农业大学，北京 100094;3.北京中海生物科技公司，北京 100081)

鸡梭菌性肠炎(Clostridial Enteritis)由产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens，简称“Cp”)引起的坏死性肠炎(Necrotic Enteritis，简称“NE”)，又称为梭状芽孢杆菌肠炎菌群失调症(dysbacteriosis)或小肠细菌生长过度症(SIBO)。病死禽以肝肿大、肠道出血和肠黏膜有麸皮样坏死灶为特征。随着对抗生素类促生长剂的禁用，该病在全世界主要养禽的国家和地区都有发生，全球经济损失达20亿美元［1］。

1 病原学

1930年，Bennetts在黑色Orpington小母鸡损伤肠道中分离出产气荚膜梭菌(又称魏氏杆菌或魏氏梭菌)，鸡感染该菌可导致死亡，后来被命名为“6日病”，受侵袭的鸡肠道粘膜鉴定出产气荚膜梭菌［2］。通过口服接种可在青年公鸡复制肠道紊乱，通过鸦片(opium)治疗可终止肠道运动。

坏死性肠炎主要由A型或C型产气荚膜梭菌产生，引起肠黏膜坏死等特征性病变，但C型不普遍。A型和C型产气荚膜梭菌均可产生α毒素，C型还可产生β毒素。产气荚膜梭菌是厌氧、产孢子、革兰氏阳性大杆菌，通过IV型菌毛运动。它是脊椎动物肠道共栖菌，可从粪便污染的环境中分离到，也是环境中分布广泛的病原菌［3］。染色体分析显示，产气荚膜梭菌缺乏产生13种必须氨基酸的遗传结构，体内主要通过外毒素的作用获得，如一些酶等［4］。它可产生至少17种毒素或潜在毒性的外源蛋白，根据起主要致病作用的α、β、ε、ζ毒素可将其分为A～E 5个产毒素型(表1)［5］。大多数菌发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖;不发酵甘露醇;发酵的主要产物有乙酸和丁酸。液化明胶，石蕊牛乳阳性，吲哚阴性。

表1 产气荚膜梭菌毒素分型

2 流行病学

NE菌株来源于鸡本身，正常鸡肠道永久地或暂时地定居着少量NE菌株。一些鸡感染来自亚临床病症鸡或排泄物污染的生存环境;一些鸡肠道形成菌落丛，加上污染的褥草及其它环境面的污染使菌落呈指数增加。在鸡群肠道合适条件下，爆发NE，将进一步增加感染［6－7］。对鸡肠道内容物中产气荚膜梭菌进行检测，75% ～95%为阳性，禽肉的阳性检出率有时高达84%［8］。

NE发生与饲养中产气荚膜梭菌污染有关，当然蝇类传播也有导致NE发生［9］;NE发生同时受到饲养管理压力、高纤维褥草、限制饮食或禁食，甚至季节的影响［5］。另外梭菌性肠炎时常受到球虫感染而恶化。早期坏死性肠炎主要与布鲁氏球虫和巨型球虫感染有关，子孢子和裂殖子产生肠道粘膜伤害，并伴随着肠道pH值下降、迁移时间提高，适宜产气荚膜梭菌定植和繁殖［10］。感染艾美尔球虫比未感染的无菌鸡盲肠粘膜中产气荚膜梭菌粘附率较高，感染梭菌和球虫鸡群死亡率比单独感染梭菌至少高 25%［11］。

实验室复制NE的关键因素及自然发病的主要危险因子在于感染有毒力的产气荚膜梭菌和创造适宜厌氧菌繁殖的肠道环境。NE菌株毒力差异大，如禽坏死性肠炎和胆管肝炎的野外分离株常可复制出坏死性肠炎，但是其它许多推定为坏死性肠炎的分离株对鸡是无毒力的(表2)［5，12］。肠道适宜环境通常是艾美尔球虫感染或免疫球虫苗后产生的肠道循环微环境的损害［10］。如共感染中，肠道产气荚膜梭菌的数量和致死率是比较高的。另外是饮食因素。如饲料中添加50%鱼粉，或添加易于在小肠中快速发酵的碳水化合物或蛋白，如小麦或大麦等［13］;再如食物中补充锌也可提高艾美尔球虫和产气荚膜梭菌的感染率［14］;拌喂含有产气荚膜梭菌肉汤培养物或接触畜群感染的褥草也可增加产气荚膜梭菌的感染率。鸡免疫成熟年龄在3～4周龄，母源抗体持续3周，这也许是2～6周龄肉鸡爆发高峰的原因;但也有报道，3～6月龄商品蛋鸡和12～16周龄后备母鸡亦有NE发生。

表2 坏死性肠炎模型中产气荚膜梭菌分离株对鸡的毒力

国外对鸡群(健康和发病鸡群)作产气荚膜梭菌分型调查，对分离自丹麦25个鸡场的279株菌和瑞典10个鸡场的53株菌进行PCR分析，显示所有菌株均为A型。进一步用PFGE(脉冲场凝胶电泳)分析，显示同一健康鸡群即使是同一个体都含有几种不同的基因，然而遭受NE的鸡却只携带一到两个产气荚膜梭菌基因［15］。我国局部地区也有鸡梭菌性肠炎的流行病学报道，2005年于洋等［16］对辽西地区感染产气荚膜梭菌的12个鸡场肉仔鸡发病情况进行了调查，肉仔鸡发病日龄为2～6日龄，地面平养，发病率为20% ～35%，发病后2～3日开始死亡，死亡率为30% ～80%。2009年倪学勤等［17－18］从对四川省地区规模化鸡场采集的150份新鲜粪便样品，分离到8株产气荚膜梭菌(占整个样品的5.3%)，多重PCR结果均为A型，分析四川地区健康鸡群存在的产气荚膜梭菌主要是A型;另从四川省成都市、雅安市、宜宾市等地的10个规模化鸡场健康鸡群的500个新鲜粪便和100个盲肠内容物样品中，分离得到34株A型产气荚膜梭菌，分离率为5.7%。REP－PCR(基因组重复序列PCR)和AFLP(扩增片段长度多态性)分析均显示出了不同鸡场产气荚膜梭菌间的遗传特性差异，即来源不同的菌株，在基因水平上表现出一定差异，为不同的基因亚型;而同一鸡场的产气荚膜梭菌主要聚为同一个群，表现亚型较单一，以某一种亚型为主，少数交叉其他亚型。与国外文献报道相比，我国鸡场产气荚膜梭菌菌株的遗传多样性较低［19］。

3 症状及病变

鸡梭菌性肠炎常见特征:精神沉郁、不愿意动、被毛皱褶，嗜睡、食欲废绝，脱水，根据发病程度可分为2类。一是临床症状型［6］:特急性病例通常1～2 h内死亡，死亡率可达50%。大面积损伤主要表现在空肠和回肠，但有时在十二指肠和盲肠也出现。小面积损伤通常表现肠管扩张充气，达正常肠管的2～3倍，肠壁薄而脆，肠道表面呈灰黑色或黑绿色，肠壁有出血斑点，但出血并不常见;肠粘膜坏死，呈大小不等、形状不一的麸皮样坏死灶，肠粘膜上附着有疏松或致密的伪膜，伪膜外观呈黄色或绿色。自然发病病例特征性组织学病变是肠粘膜的严重坏死，最初病变集中发生于肠绒毛顶端，主要表现为上皮脱落，并伴有凝固性坏死，坏死区周围有异嗜性细胞。病情稍长者，病变从绒毛顶端发展到隐窝，坏死可扩展到粘膜下层和肌层。绒毛和上皮崩解脱落，固有层充血，淋巴细胞增多，坏死灶底部成纤维细胞增生。二是亚临床症状型:肠道中的产气荚膜梭菌数量超过正常值，但达不到引起发病的数量。主要特征为动物生产性能和饲料报酬降低，表现畜禽食欲变差、饲料转化率降低、生长速度缓慢、腹泻和肠黏膜的坏死。病理表现仅在肠黏膜有局部坏死。亚临床感染有时还伴有肝炎或胆管性肝炎，眼观鸡肉色质较差，黄疸、肝肿大发白，呈网状，伴有白色星点状病灶;组织病理学损害表现为胆管超常增生，呈纤维蛋白样坏死，胆管炎，偶有局灶的肉芽肿［20］。

4 致病机理

产气荚膜梭菌进入门脉循坏和胆汁管道，产生胆管肝炎，伴随着苍白、点状损伤［6］。显微镜检发现在肝和胆管有大量的点聚集坏死，胆囊和肝外管充盈着浓重气味的物质，在坏死处出现革兰氏阳性细菌菌毛，常见无胆汁和苦胆的肝炎［21］。

经验理论认为，所有A型菌株在适宜的鸡肠道条件下均可产生坏死性肠炎的病症和损伤，但在感染实验模型中，一些来自健康鸡正常菌群或其他动物肠炎的分离株对鸡无毒力(表2)。诚然，如果肠道条件不适宜，即使是禽坏死性肠炎分离株也不能复制此病。退化的肠道运动性、肠道粘膜损伤及肠梗阻，加上饮食因素等条件，均有助于产气荚膜梭菌生长［6］。虽然肠道中较高数量的产气荚膜梭菌不足以产生坏死性肠炎，但感染坏死性肠炎每克粘膜含有106～108个菌落［10］。染色体序列分析可部分鉴定出毒力菌株的遗传标志，遗传学特征显示健康鸡含有2～5种基因型，感染坏死性肠炎或胆管肝炎呈现典型的单一基因型，在自然康复或治疗康复鸡中产生许多基因型，但无坏死性肠炎菌株的基因型，也许是坏死性肠炎菌株体外产生的细菌素起主导优势，抑制了非肠炎菌株生长［22］。

α毒素是锌依赖性磷脂酶/神经磷脂酶，一些证据表明α毒素在产气荚膜梭菌致病感染中起关键作用。如在NE病鸡禽粪中检出比健康鸡群较多的α毒素;α毒素突变体在鼠神经坏死模型中毒力下降;免疫α毒素C－端结构域能产生抵抗致死剂量攻击的中和抗体;少量健康鸡含有α毒素抗体，NE康复鸡含有高滴度α毒素抗体;NE鸡群约15%～20%在孵化后5周血清阳性，至8周几乎80%发生抗体转化;新生鸡含有α毒素抗体，高龄母鸡含有较高水平的 α 毒素抗体［13－14，23］。不过 α毒素的作用先后受到Thompson、Keyburn、Coursodon等学者的质疑［24－26］，如一些 α 毒素鸡分离株突变体在体内保持完全毒力，其对应的观点显示α毒素是保护性抗原［13，27］。再如发现由一种NetB毒素引起的坏死性肠炎，其氨基酸与β毒素存在38%同源性，与葡萄球菌α毒素存在31%同源性［28］;其自然和重组蛋白可引起细胞变圆和鸡肝肿瘤细胞裂解，突变体不能复制出NE［28］。当然，关于NetB毒素最初报道中，25%诱发坏死性肠炎菌株的NetB毒素PCR和Western blot检测阴性，而且少量鸡接种NetB毒素突变体产生典型NE小面积损伤，因这些突变体不含有甲砜氯霉素抗性，结论是由环境或当地NetB毒素阴性株引起损伤［28］。因而推断NetB毒素在菌株中也许是非必须的，Cooper和Songer的研究支持了上述结果［29］。但近几年，NetB毒素为NE关键毒力因子理论逐渐占上风。2009年，Johansson等［30］对受到温和NE影响的某一未曾饲喂过抗生素生长剂的后备肉鸡群研究发现，该鸡群流行NetB毒素且成基因多样性(88株分离株通过脉冲场凝胶电泳出现32种不同的基因型)。2009年，Abildgaard［31］从丹麦肉鸡场分离出48株A型菌株，NetB毒素基因在NE鸡群及健康鸡群分离株中分别占60%及50%;含有NetB基因菌株启动子区域保守，少许菌株编码基因变异;分离菌株体外培养，NE鸡群中12/13株NetB毒素基因检测阳性，而健康鸡群中4/14株NetB毒素基因阳性。2010年，Keyburn等［32］对54株来自澳大利亚、比利时、丹麦、加拿大NE鸡群分离株，55株来自澳大利亚、比利时健康鸡群分离株研究发现，NE分离株中70%NetB毒素检测阳性，而健康分离株仅2株检测阳性，而且NE分离株中NetB毒素基因序列高度保守，NetB毒素阴性的NE分离株在动物模型上不能诱发坏死性肠炎，表明NetB毒素是NE的关键毒力因子。但2010年Lanckriet等［33］研究却认为α毒素和NetB毒素均不一定为免疫保护力的关键因子。他们对含有α毒素和NetB毒素的8株NE田间分离株研究发现，仅1株菌株培养上清产物对强毒攻毒产生完全保护，1株产生部分保护，其它均不保护。

饮食是诱发坏死性肠炎的最重要的非细菌因素。能量高、蛋白丰富的饲料(如动物蛋白)易于发生NE，吃小麦或大麦NE发生率比吃玉米高6～10倍，死亡率高2～3倍，微生物在体外消化的麦类中比谷类更易增殖［6，34］;另外食用马铃薯类蛋白比大豆类蛋白摄入率及生长率分别低7.7%及7.8%，但其诱发肠道坏死率高(马铃薯类蛋白为23.6%，大豆类蛋白为15.3%)［35］;大豆蛋白保持最低胰蛋白酶抑制剂的活力有助于鸡群健康［36］。饲料成分的类型也影响NE发生，颗粒性饲料比蛋白粉料更易产生负面作用，颗粒性饲料的生产率较高，但较小的颗粒更易于鸡消化及产气荚膜梭菌利用［37］。

5 诊断

根据流行病学、临床症状、病理变化及实验室检验进行诊断。注意本病与溃疡性肠炎和小肠球虫感染相鉴别。溃疡性肠炎特征性剖检病变为小肠远端及盲肠上有多处坏死和溃疡灶，肝也有坏死灶;坏死性肠炎的病变为前期肠道充气扩张，中后期广泛性粘膜坏死，仅局限于空肠和回肠，不累及盲肠，脾不肿大而盲肠、肝几乎无病变;小肠球虫病特征在于肠腔内充满血凝块或粘液粘膜增厚，通过镜检可发现处于不同发育期的球虫［38］。

6 治疗及预防

由于产气荚膜菌是肠道正常寄生菌，发病的诱因主要是其过分繁殖或引起机体免疫抑制、抗病力降低而引起。所以控制诱因是防制本病的重要措施。1)注意季节变化，春、夏季易发病。2)加强粪便、土壤、垫料、饲料等卫生清理。3)减少高能量、高蛋白质日粮摄入。4)利用细菌之间的竞争性排斥。通过建立肠道正常菌群从而限制产气荚膜菌的繁殖以减少发病。如枯草杆菌孢子可竞争地排除肉鸡中的产气荚膜梭菌，乳酸杆菌、粪链球菌能抑制产气荚膜梭菌的繁殖，可减少坏死性肠炎的危害;有些益生菌(Probiotics)能降低胃肠道pH值，有利于肠道内共生菌生长繁殖，抑制病原菌生长繁殖。如饲料中增加β－甘露聚糖酶可减少NE损伤［6］。5)预防与控制好免疫抑制病。如马立克氏病、传染性法氏囊病、传染性贫血和J－亚型淋巴白血病等。6)加强饲养管理。适宜饲养密度及减少环境应激，可降低本病发生。7)饲料中可适当添加维生素，特别是维生素B，因它是一种抗氧化剂，可有效保护细胞膜，减少小肠黏膜坏死损伤。8)使用多醚离子载体类抗球虫药物，不但能作用于球虫同时也能作用于本病原菌，减少本病的发生率。9)合理并慎重使用抗生素。通过在饮用水中添加洁霉素、杆菌肽锌、土霉素、青霉素和泰乐菌素或者在食物中添加杆菌肽锌、洁霉素、维及尼霉素、青霉素、阿佛帕星和双呋咪腙等来防治。但由于动物食物中一些抗菌耐药性病原会转移给人［39］。如最重要的万古霉素抗性肠球菌(VRE)，在欧美医疗机构中成为主要问题。在禽畜饲料中使用奥沃霉素引起VRE在食用动物中的汇集，导致VRE在人体中的产生和传播［40－41］。因而欧共体取消了在饲料中使用抗生素生长促进剂［6］，从而使VRE在食用动物中的发生率大大降低，但导致NE爆发的增加，特别是在西欧，譬如法国NE的发生率从1995年的4%上升到 1999 年的12.4%［11］。另外，2009 年 Nowell等［42］从加拿大零售肉鸡中分离的产气荚膜梭菌肉汤培养物中，发现21%坏死性肠炎分离株含有NetB毒素基因，该基因可通过肉鸡传递给人。所以此法应慎重使用。综上所述，目前最实用的方法是通过抗病育种、加强饲养管理、优化饲料配方、控制球虫病和免疫抑制病的发生等来预防本病。

7 免疫

在免疫学上，鉴定了一系列免疫原性蛋白，开展了血清学及免疫效力等相关研究。尽管暂不能完全解决NE问题，但是预示不久会有好的方法。

在NE免疫血清学抗体中，通过反向遗传方法鉴定毒力菌株产生的5种免疫原性蛋白。A型毒素(CPA)、甘油醛－3－磷酸盐脱氢酶、丙酮酸盐∶铁氧还蛋白－氧化还原酶(PFOR)、果糖1，6－二磷酸缩醛酶(FBA)和假想蛋白(HP)等5种组氨酸标记表达产物免疫肉鸡。每种蛋白均能对温和毒株攻毒提供显著保护力，而CPA、HP和PFOR能对较强毒株攻毒提供显著保护力。产气荚膜梭菌A型类毒素初次免疫，用活性毒素加强免疫，能够对强毒株攻毒提供最大保护。口服免疫无毒沙门氏菌载体携带FBA或HP基因疫苗也有显著保护作用。CPA的C－末端片断被克隆入减毒沙门氏菌载体疫苗(RASV，其中pabA和pabB基因被删除突变为弱毒株)。肉鸡连续3 d口服免疫109CFU重组疫苗，可产生CPA－中和抗体，经过攻毒发现免疫后的肉鸡小肠粘膜损伤降低。另外Kyungwoo Lee［43］鉴定出延伸因子 Tu(elongationfactor Tu，简称“EF－Tu”)和PFOR为产气荚膜梭菌粘附感染肉鸡相关的两种免疫原性蛋白。

肉用种母鸡免疫A型和C型类毒素可产生较强的IgY血清抗体反应，并可传递给后代;虽然A型抗体应答高于C型，但免疫C型类毒素对亚临床NE和肝炎肉鸡保护效果更为显著［28］。肉鸡免疫重组α毒素可提供对强毒部分［23］或完全的保护。肉鸡分别在第5天和第15天皮下接种重组α毒素，在第25天攻毒，免疫鸡发生NE的几率显著低于未免疫鸡。小鸡接种有毒力的产气荚膜梭菌株(1次/d，连续5 d)，然后经杆菌肽治疗，可免受强毒再次攻击。当然也有一些不同发现，接种α毒素缺失突变体也能够起到免疫保护作用。2010年，Crouch等［44］运用NetvaxTM公司的A型类毒素与轻质矿物油乳化成苗，肌肉注射免疫接种肉种母鸡安全，精神状态和生产性能无全身副反应，可明显减少由NE引起的后代仔鸡的死亡和肠道损伤。2011年，Saleh等［45］运用当地流行毒株制备A型、C型及A+C型类毒素，皮下注射免疫7日龄商品肉鸡，0.5 mL/只，21日龄以同样剂量及途径加免一次，在35日龄进行混喂(2 L产气荚膜梭菌肉汤培养物+1 kg饲料或1 L产气荚膜梭菌肉汤培养物+2 L水)攻毒，通过全血计数(complete bloodcount，简称“CBC”)、白细胞计数、ELISA 抗体检测等结果证明免疫鸡(特别免疫A+C型类毒素)肠道损伤明显下降。非常有趣的是我们曾将A或C型类毒素用20%氢氧化铝胶配成疫苗后，皮下注射免疫14日龄肉鸡，0.8 mL/只，14日后经静脉注射A或C型毒素进行攻毒，保护效果显著，免疫鸡均可达4/5～5/5保护，不免疫对照5/5死亡;但免疫14日龄或6周龄SPF鸡，仅2/5保护，甚至不保护。这可能是SPF鸡含有较高的经蛋传递的母源抗体，这与Cooper和Songer报道［13］分析的结果一致。

8 展望

目前，禽类Cp污染的严重性和经食物链向人类传播的危险性备受关注，已提升为公共卫生问题。过去数十年对于NE的病因学，发病机理的研究取得了很大的进展，但仍面临诸多挑战，未来的研究将注重以下几点:1)进一步明确产生NE的关键毒素因子。2)建立起一个合理的病理试验模型，用于测试疾病防控措施。3)系统确定各种患病的风险因子，进行风险评估。4)深入研究禽类Cp定植和清除的机制以及其毒素产生的决定因素。5)基于高通量的细菌基因组测序和蛋白组学分析，发现类似NetB毒素的其他潜在毒素因子以及抑制毒素产生的药物。6)进一步对蛋鸡、肉鸡及SPF鸡群流行病学状况进行深入的调查研究。7)深入开展标记疫苗及亚单位疫苗的研发，并对现有的类毒素疫苗的应用效果进行综合评估，进一步完善NE系统防控措施。

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