鸡传染支气管炎病毒H52、H120和M41株的PCR鉴别方法研究

于 静，杨承槐，李俊平，李启红，刘 丹，夏业才，蒋桃珍，李慧姣

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis，IB)是由传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)引起的鸡的一种急性高度接触性呼吸道传染病［1］，主要侵害鸡的呼吸、泌尿生殖和消化系统等［2］。其特征症状为病鸡咳嗽、喷嚏、气管罗音;幼鸡流鼻液;蛋鸡产蛋数量和品质下降，是严重危害养禽业的主要传染病之一。IBV易发生变异［3］，分型复杂，不同毒株在毒力、致病性和组织嗜性上存在很大差异［4］。一些毒株用传统的种毒鉴定方法很难准确鉴别，尤其是血清型相同，但基因型不同的毒株更难鉴别。

IBV M41、H52 和 H120 株均为 M41 血清型［5］。在种毒鉴定、活疫苗鉴别检验时均用单特异的M41型高免血清中和后接种鸡胚，观察鸡胚是否出现病变，因此无法通过血清中和试验区分三个毒株。本研究采用分子生物学技术［6］，对IBV序列中差异较大的序列进行分析，建立了IBV三个毒株的PCR鉴别方法，提高了鉴别特异性。

1 材料与方法

1.1 毒种 IBV种毒株 H52、H120及 M41株，鸡传染性法氏囊病病毒B87、火鸡疱疹病毒Fc－126株以及新城疫病病毒La Sota株、鸡痘病毒鹌鹑化弱毒株，均由中国兽医微生物菌种保藏管理中心保存。

1.2 试剂 病毒RNA抽提试剂盒、病毒DNA提取试剂盒为OMEGA公司产品;反转录酶系统为Invitrogen公司产品;限制性内切酶NaeⅠ为大连宝生物公司产品;PCR产物纯化试剂盒为天根生化科技公司产品。

1.3 引物设计

1.3.1 引物A的设计 参照GenBank上发表的全基因组序列，在序列差异较明显的2898～4688 bp处设计一对引物:

该引物能从M41株基因组中特异性扩增出长度为1791 bp片断，而不能扩增H52株和H120株。

1.3.2 引物 B的设计 参照发表的 H52株和H120株的全基因组序列，设计了一对引物:

该引物能以H52株和H120株为模板特异性扩增长度为1700 bp的目的片度，在H120株扩增片段中含有一个单酶切位点NaeⅠ，而H52扩增片段中无此位点。因此，利用限制性内切酶NaeⅠ可以区分H52株和H120株。

1.4 病毒RNA、DNA的提取 参照OMEGA公司产品说明书，提取病毒RNA和DNA。

1.5 RT －PCR

1.5.1 反转录 在20 μL体系中进行，按Invitrogen M－MLV反转录酶的说明书进行。

1.5.2 PCR 在25 μL体系中进行。反应管中依次加入 ddH2O 16.3 μL，10 × Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，反转录产物2 μL，Ex－Taq 酶 0.2 μL。反应条件为:95 ℃预变性5 min;94℃ 1 min，50.0 ℃(A 引物)或46.3 ℃(B引物)1 min，72℃ 2 min，30个循环;循环结束后72℃ 延伸10 min。

1.6 PCR产物凝胶电泳 取适量 PCR产物于0.8%琼脂糖凝胶中90 V稳压电泳25 min，在紫外透射仪上观察并拍照。

1.7 引物B的PCR扩增产物的酶切 按试剂盒说明书纯化PCR产物后，用限制性内切酶NaeⅠ进行酶切。

1.8 敏感性鉴定 对IBV种毒H52、H120和M41株种毒分别进行 10 倍倍比稀释，选取 106.5～100.5EID50/mL七个病毒滴度，用RNA提取试剂盒提取RNA后，用引物A对M41株进行扩增，用引物B对H52株和H120株进行扩增。

1.9 特异性鉴定 用引物A和引物B分别扩增鸡传染性法氏囊病病毒 B87株、火鸡疱疹病毒Fc－126株以及新城疫病病毒La Sota株、鸡痘病毒鹌鹑化弱毒株，检测能否扩增出特异性基因片段。

2 结果

2.1 IBV M41株的鉴别检测 分别以IBV M41、H120和H52株为模板，用引物A进行扩增，M41株得到与预期大小相符的1791 bp片断，而H52株和H120株未扩增出目的片断，与预期结果一致(图1)。

2.2 IBV H120株、H52株的鉴别检测 分别以IBV H120、H52株为模板，用引物B进行扩增，均扩增到大小为1700 bp的片断，与预期结果一致。PCR产物经试剂盒纯化后，用限制性内切酶NaeⅠ酶切过夜，H52株没有切开，依然是1700 bp的片断，而H120株被切成两个片断，分别为1000 bp和700 bp，与预期结果相符(图2)。

2.3 引物特异性 用设计的两对引物分别对鸡传染性法氏囊病病毒、马立克病病毒以及新城疫病毒等病毒进行扩增，均没有出现特异性条带，说明这两对引物具有良好的特异性。

2.4 引物敏感性 IBV种毒 M41株、H120株和H52株三株种毒分别作10倍倍比稀释，取106.5～100.5EID50/mL共七个稀释度，每个稀释度取160 μL，用于提取RNA，然后用引物A、B进行扩增。结果表明，引物A扩增IBV M41株、引物B扩增IBV H120株和H52株的最低检测浓度均为103.5EID50/mL，即相当于480个EID50(见图3－图5。M:MarkerⅤ;1 ～ 7 依次为:106.5、105.5、104.5、103.5、102.5、101.5、100.5EID50/mL)。

图3 引物A扩增IBV M41株的敏感性

3 结语

本研究建立的分子鉴别方法具有良好的敏感性和特异性，进一步完善了IBV M41、H52和H120株种毒鉴定、活疫苗鉴别检验方法，对疫苗生产、检验具有积极意义。

［1］ Saif Y M.禽病学［M］.11版.苏敬良，译.北京:北京农业出版社，2005:108－130.

［2］ 王红宁.禽呼吸系统疾病［M］.北京:中国农业出版社，2002.

［3］ Ignjatovic J，Gould G，Sapats S，et al.Isolation of a variant infectious bronchitid virus in Australia that further illustrates diversity among emerging strains［J］.Arch Virol，2006，151:1567 －1585.

［4］ Mo Mei－ lan，WEI Zheng － ji，WEI Ping，et al.Isolation and genetic variations of HVRⅠof S gene of infectious bronchitis viruses［J］.Chinese Journal of Veterinary Medicine，2006，42(8):13－15.

［5］ Koch G，Hartog L，Kant A，et al.Antigenic domains on the peplomer protein of avian infectious bronchitis virus:correlation with biological functions［J］.Gen Virol，1990，71(9):1929 －1935.

［6］ Cavanagh D，Davis P J，Moc－ Kett A P A.Amino acids within hypervariable region 1 of avian coronavirus IBV(Massachusetts serotype)spike glycoprotein are associated with neutralization epitopes［J］.Virus Research，1988，11:141 －150.