吉祥安神丸微生物限度检查方法的探讨

杜尔再 阿瓦古丽·哈得尔 伊丽娜

（新疆巴州药品检验所，新疆 库尔勒 841000）

吉祥安神丸为蒙药成方制剂,具有调经活血，补气安神的功效，临床上主要用于治疗月经不调，产后发烧，心神不安，头昏头痛，腰膝无力，四肢浮肿，乳腺肿胀等，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准 蒙药分册》，该药品为口服给药制剂，处方中含有益母草、沙棘、诃子、红花、木香等成分。根据其给药途径和处方，应进行细菌数、霉菌和酵母菌数的测定以及控制菌—大肠埃希菌、大肠菌群的检查。《中国药典》2005年版规定建立微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌和酵母菌计数方法及控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该制剂的细菌、霉菌和酵母菌数及控制菌的测定。本试验按照《中国药典》2005年版一部附录ⅩⅢC微生物限度检查法有关规定，建立吉祥安神丸的微生物限度检查法并加以验证［1］，即采用大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌试验确定细菌数检查法，采用白色念珠菌、黑曲霉菌试验确定霉菌和酵母菌数的检查法。按《中国药典》规定，在采用常规法、培养基稀释法等方法处理样品后，加入以上5种菌，培养后回收率达70%以上，证明该法有效消除了药品对细菌的抑制作用，可用该法进行药品微生物限度检查。本试验所用样品均由新疆巴音郭楞蒙古自治州蒙医医院提供，先取1个批号的样品，选用敏感菌金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌进行预试验，摸索出合适方法后再用3个批号的药品进行试验。

1 仪器与材料

1.1 仪器：净化工作台、均质器、电子天平、生物安全柜、细菌培养箱、生化培养箱。

1.2 标准菌种：大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉菌[CMCC（F）98003]；本试验所用菌种均为第三代，以上菌种均由新疆维吾尔自治区药品检验所提供。

1.3 培养基、稀释剂及试液：营养肉汤培养基（批号：071116）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号：080616）、营养琼脂培养基（批号：080708）、麦康凯琼脂培养基（BacC）（批号：071224）、改良马丁培养基（批号：081127）、胆盐乳糖培养基（BL）（批号：0806042）、胆盐乳糖发酵培养基（批号：080218）、4-甲基伞形酮葡萄糖苷酸培养基（MUG）（批号：070604），（以上培养基生产单位为中国药品生物制品检定所，由北京牛牛基因技术有限公司提供）；0.9%无菌氯化钠溶液、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：080925），以上稀释剂自配；靛基质试液。

1.4 供试品：吉祥安神丸（新疆巴音郭楞蒙古自治州蒙医医院；批号：20080608、20080615、20080725）。

2 方法与结果

2.1 细菌、霉菌及酵母菌计数的验证［1］

2.1.1 菌液制备：①取经37℃培养18～24h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌营养肉汤培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释为50～100cfu/mL菌悬液，备用。②取经25℃培养24～48h的白色念珠菌改良马丁培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释为50～100cfu/mL菌悬液，备用。③取经25℃培养1周的黑曲霉的斜面培养物，加5mL 0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸取菌液,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释为50～100cfu/mL菌悬液，备用。

2.1.2 供试品溶液的制备：称取样品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100mL制备成1:10供试液。

2.1.3 方法验证预试验：选用金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠菌3种敏感菌株进行预试验，摸索出合适方法。

常规法：取1:10供试液1mL，分别加入敏感菌株金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌各50～100cfu，立即注入相应培养基15～20 mL，待培养基凝固后，置规定的温度下倒置培养。金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌培养24h，白色念珠菌培养48h。

培养基稀释法：取1:10供试液0.5，0.2mL，分别注入平皿，加入敏感菌株金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌50～100cfu，注入营养琼脂培养基15～20 mL，待培养基凝固后，置规定的温度下倒置培养24h。

2.1.4 方法验证预试验结果以上预试验的回收率结果见表1。

表1 敏感菌株对几种预试验方法的回收率结果比较

根据上述预试验结果,采用常规法及培养基稀释法（供试液：0.5mL/皿）试验时，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌回收率均小于70%，表明吉祥安神丸对细菌抑制作用明显；采用培养基稀释法（供试液：0.2mL/皿）试验时，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌回收率均大于70%，表明该法有效消除了吉祥安神丸对细菌抑制作用；采用常规法试验时，白色念珠菌回收率为100%，说明吉祥安神丸对霉菌和酵母菌没有抑制作用。初步确定吉祥安神丸细菌计数方法为培养基稀释法（供试液：0.2mL/皿），霉菌和酵母菌计数方法为常规法。

2.1.5 细菌数、霉菌和酵母菌数测定方法的验证［1］取3个批号的吉祥安神丸样品，细菌按培养基稀释法（供试液：0.2mL/皿）进行细菌回收率试验，霉菌和酵母菌按常规法进行加菌回收率试验，结果见表2。

表2 培养基稀释法（0.2mL/皿）5种阳性菌回收率试验结果

上述试验说明,采用培养基稀释法（供试液：0.2mL/皿）试验时，3个批号的药品中大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌回收率均大于70%，该法可用于药品细菌数检查；采用常规法试验时，3个批号的药品中白色念珠菌、黑曲霉菌回收均大于70%，该法可用于药品的霉菌和酵母菌数检查。

2.2 控制菌检查方法验证［1］

2.2.1 大肠埃希菌检查方法验证：①试验组：取1:10供试液10mL接种至100mL胆盐乳糖培养基（BL）中，同时加入大肠埃希菌10～100cfu，35℃培养24h。取培养物0.2mL接种至5mL MUG培养基试管中，35℃培养24h，在365nm紫外灯光下观察荧光，然后再进行靛基质试验。另取培养物在麦康凯琼脂培养基平板上划线，35℃培养24h，观察其菌落形态。②阴性菌对照组：取金黄色葡萄球菌作为阴性菌对照试验菌，方法同试验组。结果见表3。

2.2.2 大肠菌群检查方法验证：①试验组：取1:10供试液1ml接种至9ml乳糖发酵管培养基中，同时加入大肠埃希菌10～100cfu，35℃培养24h。另取培养物在麦康凯琼脂培养基平板上划线，35℃培养24h，观察其菌落形态。②阴性菌对照组：取金黄色葡萄球菌作为阴性菌对照试验菌，方法同试验组。结果见表4。

表3 大肠埃希菌试验结果

表4 肠菌群试验结果

3 讨论

具有抑菌性药物的微生物限度检查结果的准确性，主要取决于样品本身在试验条件下是否抑制被检微生物的生长繁殖。检验时应排除其抑制作用，使之不干扰染菌限度检验，结果方属有效。本试验通过预试验，采用排除法确认可行的方法。3批样品的验证试验结果表明：①采用培养基稀释法对吉祥安神进行细菌数的测定，3种规定试验菌的回收率均大于70%，可把外界影响、制剂工艺因素（如原材料处理）和操作者的主观因素减少到最低，更客观、公正、科学，符合《中国药典》2005年版一部附录ⅩⅢC微生物限度检查法的规定，方法可行。②采用常规法进行霉菌及酵母菌数的测定，两种规定试验菌的回收率均大于70%，方法可行；③采用常规法检查吉祥安神中的大肠埃希菌和大肠菌群，方法可行。

[1]卫生部药典委员会.卫生部药品标准·蒙药分册[S].1998:86.

[2]国家药典委员会.中国药典[S].北京：化学工业出版社,2005:附录70-79.