脑得生片物质基础的HPLC-DAD-MSn分析

陈慧贞，李云飞，钟敬华，范骁辉

(浙江大学药学院，浙江杭州 310058)

近年来，随着中医药现代化和国际化进程，中药在全球的应用日益广泛，并受到了各国药品监管部门及药物研发人员的普遍关注［1-2］。由于中药化学组成复杂，如何进行有效地控制中药质量随之成为中药研究和监管部门的重要课题［3-4］。显然，开展中药的化学物质基础研究，鉴定出其所含的主要化学成分应是建立科学质量控制方法的先决条件［5-7］。

脑得生片是一种临床上常用于治疗脑动脉硬化、缺血性脑卒中和脑出血后遗症等的复方制剂［8］，其主要由三七、川芎、葛根、红花和山楂5种药材制成。目前，已有文献研究了葛根［4，9-10］、红花［11-13］、三七［14-15］、川芎［16-18］和山楂［19-21］等药材的活性成分，并有研究人员采用高效液相(HPLC)或高效毛细管电泳(HPCE)法建立了脑得生片中的葛根素的检测方法［4，22-24］。但至今为止，鲜见同时鉴定脑得生片中多种成分的报道，导致该制剂的化学物质基础仍不明确，制约了其质量的进一步提升。

LC-ESI-MSn联用技术拥有强大的分离能力，可有效分离中药的复杂成分，进而通过质谱检测器获取其多级碎片信息，实现化合物的推断鉴定，被认为是中药等复杂物质体系的重要分析方法［25-28］。显然，采用 LC-ESI-MSn联用技术对中药进行定性分析，明确其化学物质基础，对于进一步开展药效物质基础研究或提高其质量标准具有重要意义。为此，本研究采用HPLC-DADESI-MSn联用技术建立脑得生片中多种成分同时鉴定方法，开展其化学物质基础研究。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂 Agilent 1100/LC/DAD/MS系统(安捷伦公司，美国)，含在线真空脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、光电二极管阵列检测器(DAD)、电喷雾接口(ESI)和Finnigan LCQ-DECA XP Plus离子阱质谱仪(赛默飞公司，美国)。Thermo Finnigan Xcalibur 1.3工作站。

实验试剂:乙腈(色谱纯，默克公司，德国)、甲醇和甲酸(分析纯，杭州试剂公司，中国)，以及 Milli-Q水(密理博公司，法国)。葛根素、大豆苷、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2和人参皂苷Rd对照品购于中国药品生物制品检定所，经HPLC鉴定纯度超过98%，甲醇溶液中稳定。脑得生片由吉林春光制药有限公司提供。药材三七、川芎、葛根、红花和山楂由杭州中药材饮片厂提供。

1.2 样品制备 脑得生片供试品的制备:取脑得生片1 g，去糖衣后，研成细粉，加甲醇-水溶液(体积比1∶1)20 ml，超声提取 45 min，提取液过滤，滤液 12 000 r·min-1，离心 15 min，即得。

1.2.1 药材供试品制备 原药材粉末各取5 g，加水50 ml，加热至 100℃，回流提取 2 次，每次1.5 h，每次50 ml，合并2次滤液。滤液在60℃条件下，旋转蒸发仪蒸干。残渣用50 ml的水溶解。溶液过0.45 μm滤膜，即得。

1.2.2 色谱条件 色谱柱:Agilent Zorbax SBC18柱(4.6 mm ×250 mm，i.d，5 μm)。流动相:0.05%甲酸(A)和乙腈(B)，梯度洗脱 0 min，5%B;15 ～30 min，10%B;60 min，20%B;75 min，30%B;85 min，40%B;100 min，60%B。流速:0.5 ml·min-1。DAD 检测器:190～400 nm进行全波长扫描，同时选择3个不同波长作为检测波长，分别为203 nm、254 nm和280 nm。柱温:40℃;进样体积:15μL。

1.2.3 质谱检测条件 MS同时记录总离子流(TIC)色谱图。离子极性:ESI(+/-);扫描范围:100～2000;毛细管温度:350℃;干燥气(N2)流速:30 L·min-1，辅助气体(N2)流速为10 L·min-1;毛细管电压:20 V;裂解电压:3.0 kV。离子宽度为2.0的母离子进行多级质谱分析。

2 数据分析

2.1 HPLC-DAD分析 根据中国药典(2005版)对脑得生片生产过程的记载，脑得生片中的主要化学成分是由三七、葛根、红花和山楂4种药材的水溶性成分和川芎中的挥发油组成［8］。考虑到 HPLC-DAD-ESI-MSn联用技术的特点，本研究暂不将挥发油作为研究对象。预实验表明，脑得生片中的主要化学成分是黄酮、皂苷和酚酸3类化学成分。文献研究表明，三萜类皂苷的紫外最大吸收波长在203 nm处［29-30］，酚酸的紫外最大吸收波长在210 nm和280 nm处［31-32］，黄酮的紫外最大吸收波长在250 nm和275 nm处［33-36］。因此，可以根据化合物的特征紫外吸收图快速推断鉴定化合物的母核类型。

图1为脑得生片色谱图(图1A-C)与三七提取物、葛根提取物、红花提取物和山楂提取物的色谱图进行对照(图1D-G)，脑得生片中的主要化合物色谱峰可以从各药材提取物色谱峰中找到归属。

图1 脑得生片及药材在不同波长下的HPLC-UV色谱图Fig.1 HPLC-UV chromatogram of Naodesheng tablet and extracts of herbs

2.2 对照品的HPLC-MS分析 9个对照品直接进样用于ESI-MS参数优化，葛根素、大豆苷、三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2和人参皂苷Rd。标准品经过ESI离子源电离成碎片离子，相应的碎片离子经过碰撞、诱导及解离(CID)，获取相应的二级质谱数据和多级质谱数据。通过二级质谱和多级质谱数据可以获得9个对照品的裂解模式。这可以用于脑得生片中具有相似母核化合物的鉴定。在ESI电离过程中，所有对照品的准分子离子峰是失去质子的［M-H］-，三萜类皂苷的准分子离子峰是加合AcO-离子后的加合离子［M+AcO］-。9个对照品的分子量、二级质谱数据和多级质谱获得的主要裂解碎片见表1。

2.3 脑得生片HPLC-DAD-MSn分析 脑得生片的LC-MS数据用Matlab 7.0进行噪音平滑处理。图2为脑得生片203 nm波长处的HPLCUV色谱图(图2A)和总离子流图(图2B)。

由于脑得生片总离子流图的信噪比较低，很难将TIC色谱图的组分或色谱峰与对照品的质谱数据进行对照。为此，本研究先用CODA-DW法消除噪声干扰［37］，滤噪后的总离子流图见图2C。

将脑得生片与药材提取物的HPLC-UV和HPLC-MS色谱图进行对比，制剂中大多数的色谱峰可以在原药材提取物的色谱图中找到归属。10、16、28、29、30、36、38、39 和 41 号色谱峰可以通过色谱峰的保留时间、紫外吸收光谱图和对照品的m/z值进行鉴定。脑得生片化学物质的推断鉴定结果见表2。

图2 脑得生片在203 nm处的HPLC-UV色谱图和总离子流图Fig.2 HPLC-UV chromatogram(203 nm)and total ion current chromatogram of Naodesheng tablet

表1 对照品一级质谱和多级质谱分析后的母离子和主要裂解离子Table 1 The precursor ion and main fragment ions of the reference compounds in MS and MSn analysis

表2 脑得生片中色谱峰HPLC-DAD-ESI-MS鉴定结果Table 2 HPLC-DAD-ESI-MS identification of Naodesheng tablet

续表2

由于缺少对照品，本研究通过各个色谱峰的特征紫外吸收图、一级质谱、二级质谱和三级质谱的裂解碎片和前述9个对照品的各级质谱裂解离子和裂解规律及文献数据来鉴定其它色谱峰［4，12，38-41］。

经上述方法推断鉴定，2、3、7、8、12、14、18、20、31、32和40号色谱峰分别为红花黄色素A、4'-O-葡萄糖葛根素、3'-羟基葛根素、大豆苷元-8-C-芹菜糖基(1-6)葡萄糖苷、3'-甲氧基葛根素、3'-甲氧基-6″-O-木糖葛根素、5，7-三羟基异黄酮-7-糖苷、葛根苷A、大豆苷元、鹰嘴豆素A和人参皂苷Rb3(表2)。12号色谱峰的准分子离子峰［M-H］-的m/z是445。据此推测12号色谱峰的分子质量应是446，与化合物3'-甲氧基葛根素的分子量相同。对该准分子离子进行二级质谱分析，产生脱去120 Da的碎片离子基峰，碎片离子的m/z为325(图3)。这是碳苷类化合物的特征裂解途径［39］。12号色谱峰的最大紫外吸收波长在204 nm和250 nm。这些数据与文献相符［4，39］。据此推测12号色谱峰是3'-甲氧基葛根素。

32号色谱峰的准分子离子峰［M-H］-的m/z是283。对此准分子离子进行二级质谱分析，产生缺失一个甲基的碎片离子基峰［M-H-15］-，碎片离子的m/z是268。这些数据与文献［4］的信息一致，推测32号色谱峰是鹰嘴豆素A。

3号和14号色谱峰的准分子离子峰［M+H］+的m/z是579。然而，2个色谱峰的质谱裂解途径不同。3号色谱峰的二级质谱的碎片离子基峰［M+H-162］+是缺失一个葡萄糖基获得的，m/z是417;14号色谱峰的二级质谱的碎片离子基峰［M+H-132］+是缺失一个木糖基或芹菜糖基获得的，碎片离子的m/z是447。2个色谱峰的三级质谱显示2个碎片离子基峰都缺失1个120 Da的中性片段，可以判断这2个化合物是碳苷类化合物。将数据与文献［39-40］进行对照，3号色谱峰是4'-O-葡萄糖葛根素，14号色谱峰是3'-甲氧基-6″-O-木糖葛根素。

其它色谱峰，例如:4、17、23、24、25、26 和 42号色谱峰未从药材提取物中找到对应的色谱峰。这些色谱峰极有可能是在产品生产或是在样品制备过程中产生的中间产物。另外，药厂实际生产时所用的药材可能与实验中使用的有差异。由于母离子峰度较低，1、9、15、21、22、27、33、34、35、37和43号色谱峰的三级质谱未得到很好检测。由于缺少文献数据的验证，5、6和19号色谱峰无法鉴别。上述提到的色谱峰的m/z值、紫外吸收光谱图和对应的药材和各色谱峰的数据见表2，已鉴定化合物的结构式见图4。

图3 12号色谱峰的ESI图Fig.3 ESI spectra of peak 12

图4 脑得生片中已鉴定化合物的结构式Fig.4 Structure of the identified compounds in Naodesheng tablet

3 结论

本研究运用HPLC-DAD-ESI-MSn联用技术检测和鉴定脑得生片中的化合物。根据化合物的保留时间，紫外吸收光谱图和各级质谱数据，成功推断鉴定了22个化合物，初步明确了脑得生片的化学物质基础。这一研究结果为后续提高脑得生片质量控制标准提供了基础数据，有助于开展其药效物质基础研究。

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