木香肝毒性组分筛查与GC-MS分析研究

赵筱萍，陆 琳，胡 斌，王书芳

(1.天津中医药大学，天津 300193;2.浙江中医药大学，浙江 杭州 310053;3.浙江大学药学院，浙江 杭州 310058)

木香是菊科植物木香(Aucklandia lappa Decne.)的干燥根，具有调节胃肠运动、抗消化性溃疡、抗炎、扩张血管及抗肿瘤等诸多药理活性［1-2］。中医认为，木香的功效是行气止痛、健脾消食等。有报道称，长期使用木香包合物可引起动物肝和肾毒性［3］。为此，有必要对中药材木香中潜在的毒性组分进行筛查，研究其可能含有的肝和肾毒性物质。本研究采用二乙酸荧光素荧光标记的细胞模型，对木香提取物中25个化学组分进行了肝毒性快速筛查，发现其中10个组分对人肝癌细胞(HepG2)具有明显的毒性;经气相色谱-质谱联用定性分析，C09组分的主要成分为去氢木香内酯、santamarine(或magnolialide)和 reynosin，而 C11组分的主要成分是α-木香醇和榄香醇。

1 材料与方法

1.1 仪器及材料 细胞荧光显微成像平台(浙江大学药物信息学研究所开发);酶标仪(Bio-Tek ELX800，美国宝特);Agilent 6890N/5973N气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent公司)，另配有 Agilent 7683自动进样器、NIST 2002质谱数据库和Agilent色谱工作站。

HepG2(上海细胞库);DMEM培养基、胎牛血清(Gibco公司);二甲基亚砜、胰蛋白酶(Sigma公司);二乙酸荧光素(Fluorescein diacetate，FDA，碧云天生物技术研究所);96孔细胞培养板(Corning公司);甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯为分析醇(国药集团);甲醇为色谱纯(德国默克公司);高纯水来自Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司);去氢木香内酯(上海融禾医药科技发展有限公司)。

木香化学组分样品共25个(采用标准组分制备法提取分离获得)［4］。

1.2 方法

1.2.1 肝毒性组分的筛查 待测组分溶于DMSO中，得50 mg/ml储备液，与细胞孵育的终质量浓度为 50 μg/ml。取对数生长期的HepG2细胞，以3 000个/孔接种于96孔板中，贴壁生长24 h后加入待筛查组分，共孵育48 h后采用FDA荧光标记法检测细胞活力［4］，计算细胞的存活率并判定待筛查组分的毒性［5］，当细胞存活率低于20%时，表明该组分具有明显毒性。另设溶剂对照组(0.1%DMSO)，各试验组平行3份。

1.2.2 GC-MS 分析 Agilent DB-5MS 毛细管柱(0.25 mm ×30 m ×0.25 μm);载气:高纯氦气，流速0.8 ml/min;升温程序:柱始温50℃，以10℃/min程序升温至150℃保持10 min，以5℃/min程序升温至 200℃ 保持 10 min，以10℃/min程序升温至300℃保持5 min;进样口温度300℃，不分流进样，进样量为2μL。质谱为EI(electron ionization)离子源，离子源温度为230℃;电离电压:70 eV;四级杆温度:150℃;扫描模式:全扫描，40 ～600 m/z。

2 结果

2.1 肝毒性组分的筛查 将木香药材中分离所得的25个组分分别加入HepG2细胞中孵育，采用FDA荧光标记法筛查其中的肝毒性组分。图1示A组分中有4个组分具有明显毒性，分别为 A01、A05、A08 及 A09，细胞存活率依次为 0.28% ± 0.11%、0.37% ± 0.37%、13.50% ±2.11%及0.29% ±0.08%;B 组分中B12组分具有明显毒性，细胞存活率为8.95%±1.61%;C组分中有5个组分具有明显毒性，分别为 C05、C06、C08、C09 及 C11，细胞存活率依次为 7.65% ± 1.27%、0.26% ± 0.04%、0.22% ±0.14%、0.51% ± 0.09% 及 0.02% ±0.01%。其中溶剂对照、C09及C11组分的细胞荧光显微图像见图2。

2.2 GC-MS分析 对木香肝毒性组分中低极性组分 C09、C11进行 GC-MS分析，其中 C09组分的总离子流图见图3。化合物Ⅰ的保留时间为35.39 min，经质谱数据库检索并与标准品对照，鉴定为去氢木香内酯(dehydrocostuslactone)。化合物Ⅱ、Ⅲ各主要碎片及相对丰度与文献［6］报道基本一致，推测化合物Ⅱ为santamarine(或 magnolialide)，化合物 Ⅲ 为reynosin。化合物Ⅳ经质谱数据库检索，匹配度较低，有待进一步分析。采用面积归一化法确定化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的相对百分含量分别为39.01%、11.76% 和 9.04%。C11 组分的总离子流图见图4，根据化合物Ⅴ、Ⅵ质谱图、质谱数据库检索结合文献推测化合物Ⅴ和Ⅵ分别为α-木香醇(α-costol)和榄香醇(elemol)［6-7］，采用面积归一化法确定其相对百分含量分别为42.39%和 10.40%。

图1 木香中肝毒性组分筛查结果Fig.1 Screening hepatotoxic fractions from Aucklandiae Radix

图2 溶剂对照(A)、C09组分(B)和C11组分(C)的细胞荧光显微成像图Fig.2 Fluorescence images of cells treated by vehicle control(A)，C09 fraction(B)and C11 fraction(C)

图3 C09组分和去氢木香内酯的总离子流图Fig.3 The total ion chromatogram of C09 fraction and dehydrocostuslactone

3 讨论

对筛查出的2个具有明显肝毒性的低极性组分作GC-MS分析，结果表明C09组分的主要成分为去氢木香内酯、santamarine(或magnolialide)和reynosin，而C11组分的主要成分是α-木香醇和榄香醇。这提示上述5个化学成分可能引起肝毒性。

去氢木香内酯、santamarine和 reynosin都属于倍半萜类化合物，木香中的此类成分对肿瘤细胞有较强的细胞毒作用，具有抗肿瘤的活性［8-9］，Sun 等证实去氢木香内酯、santamarine和reynosin对HepG2细胞有杀伤作用，半数致死量分别为 3.5 μg/ml、7.5 μg/ml和 11.0 μg/ml［9］。构效关系研究认为，该类成分结构中存在α、β不饱和的γ-内酯环，能与巯基发生快速迈克尔加成反应，降低细胞内GSH含量，并对细胞内含巯基的蛋白产生氧化损伤作用［10-11］。这可以解释C09组分产生明显毒性的原因。而C11组分中的α-木香醇和榄香醇也是倍半萜类化合物，但不含有α、β不饱和的γ-内酯环样结构，其可能引起肝毒性的作用机制还有待进一步研究。

图4 C11组分的总离子流图Fig.4 The total ion chromatogram of C11 fraction

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