孕期吸入异氟醚对子代大鼠认知功能及海马GAP-43和NPY表达的影响

孔飞娟，唐郁文，徐麟浩，张晓明，鲁惠顺

(1.浙江大学医学院附属妇产科医院，浙江杭州，310006;2.浙江大学医学院人体解剖教研室，浙江杭州，310058)

随着医学技术的快速发展，孕期妇女在全身麻醉下行胎儿手术及妊娠期非产科手术等与分娩无关的手术日益增多。由于大多数全身麻醉药很容易通过胎盘，因此胎儿接触麻醉药物的概率相当大。异氟醚是临床上常用的吸入性麻醉药物，同时也广泛应用于动物研究。越来越多的动物研究表明早期暴露于异氟醚可引起其成年后学习记忆能力的缺陷［1-2］。同时，临床也发现，儿童期手术和麻醉与其后行为的异常和认知的障碍存在相关性［3-4］。这些发现引起了人们对全身麻醉药物对胎儿、新生儿以及婴幼儿潜在的有害影响的关注。但是，异氟醚对胎儿神经发育影响的相关报道却很少。

生长相关蛋白-43(growth associated protein-34，Gap-43)是一种神经细胞膜上的特异性磷蛋白，它在整个大脑发育期间均维持在一个较高的水平，是公认的神经元发育、神经生长、再生、突触形成和重建的标志蛋白质［5］。而神经肽Y(neuropeptide Y，NPY)是一种36个氨基酸的多肽，主要分布在大脑皮层、丘脑、下丘脑、脑干等处，NPY作为一种神经递质，有一项重要作用是对海马学习记忆功能的调节［6］。为此，本研究观察大鼠孕期吸入异氟醚对子代学习记忆功能的影响，并通过检测仔鼠海马CA1区神经细胞GAP-43和NPY的表达来探讨异氟醚引起认知功能障的机制。

1 材料和方法

1.1 动物选择及分组 清洁级Sprague-Dewley大鼠12只，孕18 d，体质量380～420 g(浙江大学医学院实验动物中心提供)，随机分成2组:对照组和异氟醚处理组，每组6只。

1.2 异氟醚吸入 将孕18 d的SD大鼠放入20 cm×12 cm×10 cm自制麻醉箱内实施麻醉，该麻醉箱放置于预设温度为38℃的水浴箱中，以维持环境温度的稳定。在麻醉箱的两侧各有一小孔，一侧孔连接 Ohmeda 210麻醉(Datex-Ohmeda公司，芬兰)输入氧气和麻醉气体，通过调节挥发罐吸入浓度控制麻醉气体输出浓度，另一侧孔连接 F-MCI气体监测仪(Datex-Ohmeda公司，芬兰)监测流出气体中异氟醚、氧气及二氧化碳浓度。对照组吸入含有30%氧气的空氧混合气体;异氟醚组使用1.3%异氟醚(批号826005U，ABBOTT 公司，美国)处理6 h，此过程保持麻醉箱内氧浓度为30%。在异氟醚麻醉过程中，用带状婴儿脉搏血氧饱和度探头贴于孕鼠腹部，持续监测SpO2和HR，以防止麻醉过深导致孕鼠大脑缺氧。同时，在异氟醚处理6 h后经孕鼠尾静脉取血检测血糖浓度。然后，将孕鼠放回笼中，待其自然分娩。所有幼鼠均成活。

1.3 Morris水迷宫实验 从每只孕鼠子代中随机取出雌性和雄性各2只出生4周的幼鼠，进行水迷宫测试。参照以前的实验方法［1］，Morris水迷宫(淮北正华生物仪器设备有限公司)由一个直径120 cm、高50 cm的圆形水池构成，划分为4个象限，每个象限设置入水点标记，于第三象限内设一直径12 cm、高29 cm的透明平台，槽内水深30 cm，使平台没于水下1 cm，水温控制在23℃ ～25℃，水池上方安装自动摄像系统。水迷宫实验包括定向导航实验和空间探索实验，共进行5 d。其中，定向导航实验为期4 d，从大鼠出生后第29天持续到第32天，检测大鼠对水迷宫学习和记忆的能力，每天训练4次，上午9:00-11:00;将大鼠分别从4个象限入水点面向 池壁放入水中，记录120 s内寻找到平台的时间(逃逸潜伏期)，并让大鼠在平台上停留20 s，超过120 s未能找到平台者，用木棒轻柔的将其引上平台并停留20 s，将其寻找平台时间定为120 s，取4次测定结果的平均值为当天的逃逸潜伏期。空间探索实验为期1 d，于大鼠出生后第33天进行，测试大鼠对平台空间位置记忆的能力，撤去平台，从任一象限将大鼠面向槽壁放入水中，记录120 s内在原平台处穿越次数以及第三象限活动时间。用Morris水迷宫数据采集和分析软件记录相关数据及图像结果。

1.4 免疫组织化学 Morris水迷宫试验结束后，每组随机取6只仔鼠用1%戊巴比妥钠(40 ml/kg)腹腔注射麻醉，快速开胸暴露心脏，经左心室向升主动脉内插管灌注生理盐水及4%冷多聚甲醛固定液。取出脑组织置于相同固定液内。将保存在多聚甲醛固定液的脑组织取出，常规脱水、透明、浸蜡、包埋。自上丘至视交叉节段由头侧向尾侧行冠状连续切片，片厚5 mm，贴附于涂有铬矾明胶的载玻片上，进行GAP-43和NPY酶标免疫组织化学染色。待抗原修复后加入第一抗体液(兔抗大鼠GAP-43单克隆抗体1∶100，兔抗大鼠NPY多克隆抗体1∶100，Santa Cruz 公司，美国)。湿盒孵育，4℃过夜;以PBS代替一抗作阴性对照。二抗采用HRP标记羊抗兔多聚体，DAB显色，显微镜下控制时间，充分冲洗中止反应，苏木素复染、脱水、透明、封固。每只大鼠各取1张相同部位DAB染色切片，采用 UTHSCSA Image T001s 3.0(美国德克萨斯大学医学院开发)图像分析处理系统进行分析，统计切片单位面积内(mm2)阳性细胞的数量和光密度。

1.5 统计学处理 采用SPSS 11.0进行统计学处理，数据以均值±标准差表示，定向导航实验中组内各天数间比较采用重复测量方差分析，其它数据采用Student's t-test进行组间比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 孕鼠吸入诱导剂量的异氟醚数分钟内翻正反射均消失，呈持续睡眠状态。鼻唇、趾端肤色保持红润，呼吸频率＞90次/min，SpO2和HR无明显波动。对照组和异氟醚组处理前后血糖差异无统计学意义(P＞0.05)，对照组:(6.22 ±1.33)mmol/L vs(6.44±0.05)mmol/L，异氟醚组:(6.42 ± 1.43)mmol/L vs(6.50 ±0.89)mmol/L。

2.2 Morris水迷宫实验 在定向导航实验中，异氟醚组仔鼠每天平均逃逸潜伏期均明显比对照组长(P＜0.05)，见表1;空间探索实验中，异氟醚组仔鼠第三象限活动时间明显短于对照组［(48.76 ±3.52 vs 35.08 ± 4.33)s，P ＜ 0.05］，穿越原平台次数明显比对照组少(3.95±1.39 vs 2.78 ±1.40，P ＜0.05)。

表1 各组仔鼠定向导航实验结果Table 1 The results of place navigation test in both group

2.3 免疫组化检测 GAP-43在两组仔鼠的额叶皮质、海马CA1区、齿状回区神经元胞体和突起的胞膜上均有表达;但是，异氟醚组仔鼠神经元表达GAP-43强度较对照组明显下降(图1-A、B)，其中异氟醚组仔鼠在海马CA1区单位面积表达GAP-43的细胞数量为(1.55±0.31)个/mm2，光密度为 58.98 ±4.05，而对照组仔鼠表达 GAP-43的细胞数量为(2.80±0.47)个/mm2，光密度为 69.24 ±5.58，两者差异有统计学意义(P ＜0.01)。

NPY在两组仔鼠的海马CA1区中均有表达，异氟醚组仔鼠NPY表达阳性的神经细胞数目较对照组有明显减少(图2-A、B)，其中异氟醚组仔鼠在上述区域单位面积表达NPY的细胞数量为 1.91 ±0.34 个/mm2，光密度为 53.92±6.16，而对照组仔鼠表达NPY的细胞数量为(4.10 ± 0.38)个/mm2，光密度为 62.28 ±5.53，两者差异有统计学意义(P ＜0.01)。

3 讨论

异氟醚在临床上常用于各种手术的麻醉，包括妊娠期胎儿手术、妊娠期非产科手术，以及婴幼儿和新生儿手术的麻醉。从神经突触发育的成熟度方面来对比，怀孕18 d的胎鼠脑发育程度相当于人类孕中期的胎儿［7］。临床上胎儿手术及孕期非产科手术的时间多选择在孕中期进行［8］，因此本研究选择该时间点作为麻醉处理点。异氟醚最低有效肺泡浓度为1.1% ～1.2%［9］，而满足临床手术常用所需最低有效肺泡浓度为1.2% ～1.3%，因此本研究选用1.3%异氟醚处理。实验结果显示，1.3%异氟醚麻醉对孕鼠呼吸无明显影响，PaO2及PaCO2在正常范围;孕鼠SpO2和HR也在正常范围，未见呼吸抑制，血糖在正常范围，排除了低氧和低血糖对实验结果的干扰。Morris水迷宫实验是研究与海马功能直接相关的空间学习和记忆的一种经典模型，定向导航实验的逃逸潜伏期可反映获取空间信息的能力，而空间探索实验的行为反映了对在定向导航实验中训练获取信息的记忆储存及再现能力。本实验发现孕鼠吸入异氟醚后，仔鼠在水迷宫实验中的逃逸潜伏期明显延长，而在原逃逸平台所处的第三象限的活动时间和穿越原平台位置的次数均明显减少，提示子代大鼠学习空间信息的能力和对获取的信息的记忆功能可能受到影响。

学习和记忆是认知功能的两个重要方面。而海马是学习记忆的关键脑区，该区突触可塑性是学习记忆的物质基础，尤其在海马CA1区和DG区［10］。GAP-43是突触可塑性的标志性蛋白，广泛分布于神经元，尤其在正在发育的轴突以及突触前末梢，参与轴突的生长，突出再生，突出重塑以及神经递质的释放。在神经系统的发育过程中，GAP-43是神经元发育和再生的一个重要因子，GAP-43不仅能够调节神经元对轴突引导信号的反应，而且在引导轴突生长和调节轴突形成新的联系上也起关键作用，是神经元发育和可塑性的分子标志物［11］。GAP-43和PKC基因的过表达明显增强转基因鼠的长时程增强(long term potential，LTP)和学习能力，因LTP与记忆有关，表明GAP-43基因与学习、记忆的调节有关［12］。也有研究发现GAP-43的表达在认知功能损害的糖尿病大鼠脑中海马区的表达下降，说明GAP-43与学习及记忆能力密切相关［13］。实验结果显示，GAP-43在异氟醚组仔鼠的海马CA1区表达明显减少，这与异氟醚组仔鼠在水迷宫实验中表现出的记忆和空间认知能力下降相吻合，显示脑内GAP-43的减少影响突触和突触连接的形成，从而引起了认知功能的下降。

此外，NPY作为一种神经调节物质可促进海马的神经前体细胞的增殖［14］。既往国外已有多项研究显示，在伴有学习记忆损害的疾病中见到中枢神经系统NPY免疫反应阳性神经元含量明显下降。研究发现，在小鼠第三脑室注射NPY，观察小鼠在跳台被动回避反应中学习记忆能力的变化，结果提示NPY对记忆的巩固和再现有明显的促进作用［15］。进一步研究还表明，NPY不但与长时记忆存在密切关系，也可显著影响短时记忆的准确性［16］，说明NPY表达程度的多少，是决定学习记忆能力的细胞和分子基础，这与同类研究的结论一致［17-18］。本研究观察到NPY免疫反应阳性神经细胞在异氟醚组仔鼠海马CA1区明显减少，提示NPY可能与异氟醚引起的学习记忆伤害有关。

综上所述，大鼠孕期吸入异氟醚后可引起子代学习记忆功能降低，这可能与GAP-43和NPY的表达下调有关，其深入机制有待于进一步研究。

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