Toll样受体4与脓毒症性急性肾损伤

桂兰兰 综述 谢红浪 审校

脓毒症是由细菌、病毒或真菌感染引起的全身性炎症反应综合征(SIRS)。全世界每年约有1 800万脓毒症患者，常合并低血压(休克)、单一或多脏器衰竭，死亡率达 25%～70%［1，2］。急性肾损伤(AKI)是脓毒症最常见的严重并发症之一，是脓毒症患者死亡率增加的独立危险因素［3］。传统观点认为，肾血流量(RBF)减少是脓毒症性AKI的主要机制，主要依赖液体复苏及血管活性药物治疗，但临床疗效不佳［4］。事实上，RBF在脓毒症早期可能会减少，但复苏后因存在高动力循环，RBF正常甚至增加，在肾脏灌注充足情况下依然存在AKI［5］。因此，AKI发病机制远比肾脏低灌注复杂，细胞凋亡、肾小球及管周微循环障碍、氧化应激、线粒体功能障碍和炎症反应等多种因素都参与脓毒症性AKI的发生。

Toll样受体(TLRs)存在于固有性免疫系统和适应性免疫系统细胞表面，提供病原体和生物相互作用界面。TLR4是识别革兰阴性菌胞壁成分脂多糖(LPS)的主要受体，参与炎症反应。近期研究证实，阻断TRL4信号通路可抑制炎症介质表达，提高脓毒症患者生存率。本文就TLR4信号通路在脓毒症性AKI的发病机制和治疗前景作一简述。

脓毒症性AKI的炎症机制

凝血-炎症网络在脓毒症病理生理机制中具有重要意义(图1)［6］，炎症反应是AKI直接发病机制之一。脓毒症过程可分为炎症反应和代偿性抗炎反应两个阶段。最初表现为明显炎症反应，产生大量前炎症因子如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1(IL-1)等，进一步作用于巨噬细胞或树突状细胞，刺激下游细胞因子IL-6、IL-8生成，引起组织损伤;在初始爆发性炎症反应后，逐渐诱发抗炎反应，如产生抗炎症因子IL-10、出现抗原提呈无效、T淋巴细胞低反应性、T辅助淋巴细胞1(Th1)增生降低，使患者处于免疫麻痹状态进而继发感染或对治疗干预无效［7］。

TNF-α和IL-1是脓毒症时诱发AKI的主要因子，对宿主作用广泛。动物实验发现，注射LPS后猪肾小球内皮细胞和系膜细胞TNF-α表达增加，肾皮质动脉血管内皮细胞IL-1β表达增加［8］。TNF-α受体缺失的小鼠，在注射LPS后肾小管上皮细胞凋亡及肾组织中性粒细胞浸润明显减轻，从而避免LPS介导的AKI发生［9］。Knotek等［10］予野生型鼠腹腔注射可溶性TNF-α受体p55，1h后再注射LPS，预处理组肾小球滤过率下降幅度低于对照组(30%vs 70%)，即中和TNF-α可保护LPS诱导的野生鼠肾功能损伤。TNF-α及IL-1导致AKI发生的机制包括诱导细胞因子释放，放大炎症级联反应;表达组织因子促进局部血栓形成;诱导肾小管上皮细胞凋亡;增加活性氧产生导致局部氧化应激等［11，12］。

动物实验表明，通过调控TLR4信号转导通路调节炎症免疫反应，影响脓毒症的发展［13］。因此，对TLR4的研究越来越受到国内外学者的重视，研究阻断或抑制TLR4信号转导通路的药物也是目前研究热点。

图1 简化的脓毒症病理生理过程［6］

TLR4通路与炎症因子调控

TLRs是一类模式识别受体家族，通过介导细胞信号转导系统导致炎症因子的释放，从而在识别病原微生物、启动炎症应答中起重要作用。TLR4是TLRs家族成员之一，是识别革兰阴性菌细胞外壁LPS成分的主要受体。在LPS诱导的AKI中发挥重要作用，通过阻断TLR4信号通路可带来脓毒症AKI治疗新手段(图2)［14］。

图2 TLR4 信号通路［14］

TLR4结构 TLR4属于Ⅰ型跨膜蛋白，由胞外区、跨膜区和胞内区三个部分组成。胞外区由24个亮氨酸重复(LRR)序列组成，整个LRR结构域呈马蹄形。胞内区则存在一段序列保守区，含有大约200个氨基酸残基，由Toll同源结构域和分子羧基端长短不同的短尾肽(0～22个氨基酸)组成。该序列与IL-1受体胞内区保守序列具有高度的同源性，称为Toll样受体/IL-1同源结构域(TIR)。

TLR4信号转导胞外部分 TLR4主要识别LPS及具有类脂A结构的衍生物。首先内毒素结合蛋白(LBP)将LPS从细菌外膜上转移下来，并与其脂质A结合，形成LPS-LBP复合物。然后将复合物中的LPS传递给膜结合CD14(mCD14)，再由mCD14将LPS传递给TLR4。在髓样分化蛋白2(MD-2)的协同作用下，LPS激活TLR4并触发信号转导。

TLR4信号转导胞内部分

髓样分化蛋白88(MyD88)依赖性信号转导途径 TLR4与配体结合后促使其本身二聚体化，并使胞内区的TIR区域构象发生变化。MyD88羧基端与TIR区域结合，氨基端的死亡片段可与IL-1相关蛋白激酶(IRAK)结合，导致IRAK发生自身磷酸化。磷酸化的IRAK与胞质内的TNF受体相关因子6(TRAF6)结合，介导两种不同的信号转导通路。一条通路通过激活转化生长因子活化激酶1(TAK1)提高核因子抑制蛋白(IκB)激酶复合物活性(IKK)，作用于IκB使之磷酸化、泛素化最终被降解从而活化核因子 κB(NF-κB)。NF-κB 转运到胞核其活性二聚体可启动 TNF-α、IL-6、IL-8和IL-12p40等炎症介质释放。另一通路则通过激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族，包括cjun氨基末端激酶、p38和细胞外信号调节激酶，最终活化转录激活蛋白1(AP-1)，而AP-1有刺激细胞增生、转化和死亡的作用。

MyD88非依赖性信号途径 主要通过Toll样受体相关的干扰活化子(TRIF)相关接头蛋白分子(TRAM)引起NF-κB迟发激活和干扰素调节因子3(IRF-3)激活。活化IRF-3诱导包括β干扰素在内的一系列基因的转录，如可诱导干扰素诱导蛋白10、糖皮质激素衰减反应基因16、干扰素调节基因1表达和树突状细胞的成熟。

TLR4信号通路与脓毒症炎症因子调控 LPS与巨噬细胞或树突状细胞表面TLR4结合后，通过MyD88依赖性或非依赖性反应通路激活NF-κB。NF-κB进入胞核调控产生一系列前炎症介质如TNF-α、IL-1，继而产生大量继发性炎症介质如IL-6、IL-8;同时调控CD80、CD86等辅助刺激因子表达，在辅助刺激因子帮助下，初始T细胞分化为Th1和Th2诱导体液免疫和细胞免疫［15］。TLR4胞内信号通路产生的炎症介质可进一步激活NF-κB，形成正反馈的级联放大效应，产生过度的炎症反应，严重时产生SIRS，最终导致脓毒症及多脏器功能障碍综合征。

TLR4信号通路与脓毒症性AKI

TLR4不仅表达于固有免疫细胞(如单核细胞、中性粒细胞及树突状细胞)表面，也在肾脏远曲和近曲小管上皮细胞、包曼囊上皮细胞及肾血管内皮细胞表达［16］。大量研究显示TLR4在脓毒症发病中的重要性，但TLR4与脓毒症性AKI的相关研究却不多。盲肠结扎穿孔可诱发多种微生物感染而导致脓毒症发生，在该动物模型中研究发现TLR4在近曲小管及远曲小管上皮细胞、肾小球、肾血管表达显著增加［17］。C3H/HeJ小鼠由于 TLR4基因第3个外显子发生了点突变，导致其编码的蛋白质多肽链第712位组氨酸由脯氨酸代替，从而改变了TLR4信号通路。注射0.25mg LPS后24h监测血尿素氮水平，未发现 C3H/HeJ小鼠有 AKI征象，在注射LPS 2h后C3H/HeJ小鼠外周血也未检出TNF-α，且肾组织中性粒细胞浸润及肾脏细胞凋亡更罕见［18］。

以上研究支持TLR4参与脓毒症性AKI的发生，而TLR4在肾脏细胞及肾外细胞均有表达，El-Achkar等［19］认为内毒素通过两种途径造成肾小管上皮细胞及肾血管内皮细胞损伤。除了与固有免疫细胞TLR4结合后释放系统性炎症因子间接作用于肾脏引起损伤，还可作用于肾小管上皮细胞及内皮细胞TLR4，引起局部炎症反应和氧化应激，直接造成肾脏损伤。Cunningham等［18］认为肾外 TLR4在内毒素诱导肾脏损伤中起主要作用，而肾脏TLR4仅在LPS诱导的TNF-α介导的肾小管及血管细胞凋亡发挥较小的作用。该研究将C3H/HeJ小鼠肾脏交叉移植给野生型小鼠后，小鼠血尿素氮水平升高明显，而将野生型小鼠肾脏移植给C3H/HeJ小鼠后，小鼠虽然出现血尿素氮水平升高，但较升高幅度明显低于前者，可抵抗LPS诱导肾脏损伤。

阻断TLR4通路治疗脓毒症AKI

瑞沙托维(TAK-242) TAK-242化学名称(6R)-6-［(2-氯-4-氟苯基)胺］磺酰基-1-环己烷-1-羧酸乙酯，分子式 C15H17CIFNO4S，分子量361.82。TAK-242是小分子TLR4信号通路抑制剂，可直接与TLR4胞内结构域TIR半胱氨酸(Cys)747结合，抑制TIR与其接头蛋白如Toll/IL-1受体衔接蛋白(TIRAP/Mal)、TRAM结合，从而阻断TIRAP介导的NF-κB及TRAM 介导的NF-κB、干扰素等激活，最终抑制 NO、TNF-α、IL-6等多种细胞因子产生［20-22］。

Fenhammar等［23］通过随机对照研究，首次探讨了TAK-242对脓毒症时肾功能的保护作用。因人类的TLR4与羊相似，故该作者选择20只成年特克塞尔杂交羊为实验动物，通过24h持续注射LPS［3μg/(kg·h)］诱导脓毒症模型。实验组首先静脉推注2mg/kg TAK-242，后续 4mg/(kg·d)维持。结果发现，注射LPS后动物出现低血压，心动过速，心脏指数下降，同时出现尿量及肌酐清除率下降，血肌酐、尿素氮、乳酸盐水平升高。与对照组相比，TAK-242显著改善血压，尿量和肌酐清除率，同时血肌酐、尿素氮、乳酸盐水平及尿NAG水平显著下降。该研究表明在出现AKI前使用TAK-242可减轻LPS诱导的羊肾脏损伤。同时提出需更进一步研究TLR4激活后导致AKI的完整机制，及TLR4抑制剂是否能逆转已经存在的AKI，阻断TLR4信号是否能有效保护细菌感染导致的AKI。

在Ⅰ期临床试验中，健康受试者注射TAK-242可抑制TNF-α、IL-1和IL-6产生，伴发轻度溶血及高铁血红蛋白血症，但无临床意义［24］。近期 Rice等［25］进行了随机双盲安慰剂对照试验，其目的在于确定TAK-242降低细胞因子的最佳给药方案，评估药物疗效及安全性。共纳入93个重症监护中心274例严重脓毒症、休克或呼吸衰竭患者，分为安慰剂组、低剂量 TAK-242 组［1.2mg/(kg·d)］、高剂量TAK-242组［2.4mg/(kg·d)］。遗憾的是，该研究发现无论低剂量组还是高剂量组均未抑制IL-6水平;28d全因死亡率高剂量组低于安慰剂组(17.4%vs 24.2%;P=0.26)，但低剂量组与安慰剂组类似(22.0%vs 24.2%;P=0.73)。该研究结果表明TAK-242治疗耐受性良好，但未能显著提高生存率。由于研究第一阶段观察到IL-6水平无明显下降即停止纳入患者，研究对象数量相对较少，因此TAK-242能否改善人类的生存率尚无明确结论。未来需要大样本、前瞻、随机临床试验确定TAK-242是否确实能提高脓毒性休克和呼吸衰竭患者的死亡率［25］。

依立托仑四钠(E5564)E5564化学名称3-O-癸基-2-脱氧-6-O-［2-脱氧-3-O-［(3R)-3-甲氧基癸基］-6-O-甲基-2-［(11Z)-1-氧代-11-十八烯基］氨基-4-O-磷酰基-β-D-吡喃葡萄糖］-2-［(1，3-二氧代十四烷基)氨基］-α-D-吡喃葡萄糖 1-(二氢磷酸)，分子式:C66H122N2O19P2.4Na，分子量1 401.59。LPS 由脂质A、核心多糖和O抗原三部分组成，其中脂质A为主要毒性成分，结构保守。E5564是人工合成类球红杆菌LPS脂质A结构类似物，直接与MD-2的疏水口袋结合，与脂质A竞争性结合同一位点，从而防止TLR4二聚体形成和细胞内信号转导［26，27］。

研究表明TLR4参与并介导肾脏缺血再灌注损伤(RIRI)过程［28］。Liu等［29］建立 SD 大鼠 RIRI模型予E5564治疗，而对照组给予生理盐水治疗，观察各组的肾功能情况、肾组织光镜病理，并测定检测肾组织炎症因子趋化因子的表达。结果E5564可有效地抑制中多种炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的表达，减轻肾组织的损伤程度。与RIRI类似，TLR4参与脓毒症条件下AKI的炎症反应，因此E5564同样可以减轻脓毒症肾脏损伤。

体外实验证实，E5564可抑制LPS刺激的人类、小鼠、大鼠、豚鼠来源的单核巨噬细胞等，多种细胞产生 IL-1β、TNF-α、IL-6 和 IL-8等细胞因子［30］。

Ⅰ期临床试验已证实E5564的安全性和耐受性［31］。一项前瞻随机双盲安慰剂对照的多中心，剂量增加的Ⅱ期临床试验，观察E5564是否降低严重脓毒症患者28d死亡率。共纳入300例患者，分安慰剂组，低剂量组(45mg，2次/d，共6d)，高剂量组(105mg，2次/d，共6d)。三组脓毒症患者合并急性肾损伤比率分别为 21.9%，17.5%，20.2%。研究发现在APACHEⅡ评分高的危重患者高剂量治疗组死亡率低于安慰剂组(33.3%vs 56.3%，P=0.105)，表明E5564具有较好耐受性，在严重脓毒症患者及预测高死亡率患者，高剂量E5564可降低死亡率［32］。一项关于国际性多中心严重脓毒症患者静脉注射105mg E5564的临床Ⅲ期研究已经结束，其结果及相关数据正在进一步统计分析中(NCT00334828)。

小结:TLR4在脓毒症性AKI中发挥了重要的致病作用，TLR4信号通路可成为脓毒症性AKI治疗的新靶点。目前TLR4阻断剂治疗脓毒症已经进入Ⅲ期临床试验，但是这些研究并未显著改善患者的生存率，尚有待进一步扩大样本以证实其用法和临床疗效。

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