双水相萃取丽江山慈菇中的秋水仙碱

石 瑶，杨亚玲，李晚谊，刘谋盛

1昆明理工大学生命科学与技术学院昆明650500;2云南省农业科学院药用植物研究所昆明650223

双水相萃取丽江山慈菇中的秋水仙碱

石 瑶1，2，杨亚玲1*，李晚谊2，刘谋盛1

1昆明理工大学生命科学与技术学院昆明650500;2云南省农业科学院药用植物研究所昆明650223

建立了由聚乙二醇(PEG6000)与(NH4)2SO4形成的双水相体系萃取丽江山慈菇中秋水仙碱的新方法。考察了PEG分子量、PEG的浓度、(NH4)2SO4的浓度和pH值对双水相成相及秋水仙碱萃取率的影响，并结合HPLC对萃取相进行检测。结果表明:PEG6000质量分数为8%，(NH4)2SO4质量分数为20%，pH为7.0时，双水相体系对丽江山慈菇粗提液中秋水仙碱萃取率达82.09%，富集倍数为6.84倍。此方法可用于丽江山慈菇中秋水仙碱的初步分离富集，且操作简单，绿色无污染。

丽江山慈菇;秋水仙碱;双水相体系;HPLC

秋水仙碱是由百合科植物秋水仙中发现的一种重要的卓酚酮类生物碱，对细胞有丝分裂有明显抑制作用，在临床中主要作为抗癌药物使用，此外，对急性痛风性关节炎有特异治疗作用，作为抗痛风药使用。我国主要从丽江山慈菇的鳞茎中获得秋水仙碱。丽江山慈菇Iphigenia indica又名草贝母、假贝母、山慈菇，为百合科多年生草本，分布于我国西藏、四川和云南中部及西北部的草地、沟边及松林中的酸性沙壤土及红土地带［1］。目前，从丽江山慈菇中提取秋水仙碱多用毒性较大的有机溶剂进行萃取，双水相萃取技术用于秋水仙碱的提取尚未见报道。

双水相萃取技术(ATPE)以萃取条件温和、操作简单、无有机溶剂残留、过程易于放大等优点在提取和分离蛋白质、酶、氨基酸及抗生素等的研究报道很多［2-5］，而用于天然药物有效成分提取和分离主要集中于黄酮类化合物的分离［6-11］，用于生物碱分离的报道很少。曾报道过运用双水相萃取技术及高效液相色谱从罂粟壳中提取测定罂粟碱［12］。本文研究了以聚乙二醇(PEG)和(NH4)2SO4构成的双水相萃取体系用于丽江山慈菇粗提液中秋水仙碱的萃取，获得较好的实验结果。

1 实验部分

1.1 实验原料及化学试剂

原料:丽江山慈菇购自云南药材市场;秋水仙碱标准品购自中国药品生物制品检验所(批号: 101176-201001)。

试剂:分子量分别为400、600、4000、6000的聚乙二醇(PEG)、硫酸铵、磷酸、硼酸、醋酸、氢氧化钠均为分析纯、乙腈为色谱纯、水为超纯水。

1.2 主要仪器

Agilent1200高效液相色谱仪(四元泵、DAD检测器、自动进样器)，R-210型旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司)，KQ100DB超声仪(昆山市超声仪器有限公司)，pH计(雷磁PHS-3C)，800型离心沉淀器(上海手术器械厂)，FA1004型万分之一分析天平(上海精科天平)。

1.3 实验方法

1.3.1 山慈菇粗提液的制备

称取山慈菇粉1.0 g，以1∶8的料液比加入50%乙醇，于超声仪中处理30 min，抽滤，收集滤液，滤渣重复提取一次，合并滤液，减压浓缩至一定体积，得山慈菇粗提液。

1.3.2 双水相萃取分离

双水相体系按质量配制，各组分用质量分数表示。将一定质量的PEG及(NH4)2SO4加入至10 mL具塞刻度离心管中，加入一定量山慈菇粗提液，加水至10 g，充分混合振荡溶解后，以3500 r/min离心5 min使其分相完全。此时，离心管中分为两相，上相为PEG相，下相为盐相。读取上下相体积，取样分析PEG相中秋水仙碱含量。相关计算公式如下:R=Vu/Vd，Y=(Cu×Vu)/(Co×Vo)×100%

式中:R-相比;Vu-上相体积;Vd-下相体积;Y-萃取率(%);Cu-秋水仙碱在上相中的质量浓度(mg/ mL);Co-萃取前秋水仙碱的质量浓度(mg/mL);Vo-萃取前体积。

1.3.3 秋水仙碱含量测定

采用高效液相色谱法测定丽江山慈菇粗提液及萃取液中秋水仙碱的含量。色谱条件:色谱柱:Agilent TC C18色谱柱(150×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈∶水溶液(27∶73);流速:1.0 mL/min;进样量:5 μL;检测波长:245 nm;柱温:室温。

2 结果与讨论

2.1 双水相体系考察

对影响秋水仙碱萃取率的因素:PEG分子量、PEG的浓度、(NH4)2SO4的浓度和pH值进行了考查研究，确定最适萃取条件。

2.1.1 PEG与(NH4)2SO4双水相体系相图

根据文献［12］报道，制作了双水相体系相图见图1。

图1 PGE-(NH4)2SO4双水相体系相图Fig.1 Phase diagrams of PGE-(NH4)2SO4aqueous two-phase systems

由图1可见，PEG的分子量越大，双节线越趋向于原点，成相的临界浓度越低。随着PEG分子量的增加，成相所需的PEG及(NH4)2SO4的浓度均逐渐减小。

2.1.2 PEG分子量对秋水仙碱萃取率的影响

PEG分子量大小与双水相成相体系的组成及成相后的相比有很大关系。根据PGE-(NH4)2SO4相图可知，随着PEG分子量的增加，相同浓度的PEG成相所需的盐的量逐渐减少，成相能力为PEG6000＞PEG4000＞PEG2000 ＞PEG600＞PEG400。本实验 在 PEG 质 量 分数为 8%，(NH4)2SO4质量分数为20%，pH=7.0的条件下，考察了PEG分子量大小对秋水仙碱萃取率的影响。结果如表1所示。

表1 PEG分子量对秋水仙碱萃取率的影响Table 1 Effect of PEG molecular mass on extraction efficiencies of colchicine

由表 1可以看出，在此条件下，PEG400及PEG600未能成相，PEG4000及PEG6000可以成相，且PEG6000萃取率最高。这是由于PEG分子量越低，其水溶性越好，成相的临界浓度越高，所需的PEG的量也就越大，相比也随之增大，这样不利于秋水仙碱的富集。而随着PEG分子量的增大，相同质量的PEG中所含端基数目减小，使得与水形成氢键的位点减小，因而疏水性增加，且PEG分子间作用力增大，所以更容易成相［13］。故选择PEG6000进行实验。

2.1.3 PEG的浓度对萃取率及相比的影响

考察了不同浓度PEG6000对秋水仙碱萃取率的影响。固定(NH4)2SO4质量分数为20%，pH= 7.0，分别选择了五个不同浓度:PEG质量分数为2%，4%，6%，8%，10%，12%考察其对萃取率及相比的影响。结果如图2、3所示。

由图2、3可以看出，随着PEG浓度的增加，相比不断增大，上相体积增大，萃取率也随之上升。PEG质量分数为8%时，萃取率最高为85.5%，之后，随着PEG量的增加，PEG相体积增大，但萃取率基本维持不变。这可能是由于PEG浓度增大，溶液黏度增大，反而不利于秋水仙碱进入上相，故综合考虑萃取率及富集效果，选择PEG质量分数为8%进行实验。

2.1.4 (NH4)2SO4浓度对萃取率及相比的影响

图4 硫酸铵质量分数对萃取率的影响Fig.4 Effect of(NH4)2SO4concentration on extraction efficiencies of colchicine

盐的浓度对双水相成相后的相比及萃取率也有较大影响。固定PEG质量分数为8%，pH=7.0的条件下，考察了(NH4)2SO4质量分数为13%，15%，18%，20%，25%，30%对萃取率及相比的影响。结果如图4、5所示。

图5 硫酸铵质量分数对相比的影响Fig.5 Effect of(NH4)2SO4concentration on the phase ratio

由图4、5可以看出，当PEG质量分数一定时，随着(NH4)2SO4浓度的增加，萃取率逐渐升高，当(NH4)2SO4质量分数为20%时，萃取率达到最高为85.4%，之后反而下降。相比随着盐用量的增加而减小。在此体系中，(NH4)2SO4的浓度低于10%时，不能成相，高于30%后，盐不能完全溶解，且过高的含盐量对下一步进HPLC检测有影响，可能对C18柱有损害，故确定(NH4)2SO4用量为20%。

2.1.5 pH值对萃取率的影响

用质量分数为 8%的 PEG6000及 20%的(NH4)2SO4制备双水相体系，用三酸缓冲液调节体系pH值考察秋水仙碱的萃取率随pH值的变化情况，结果如图6所示。

图6 pH值对萃取率的影响Fig.6 Effect of pH on extraction efficiencies of colchicine

由图6可知，在pH为5.0～9.0的范围内，秋水仙碱萃取率逐渐升高，pH=7.0时，萃取率最高，达到86%。在偏碱性环境中，萃取率与在中性环境中基本一致。而酸性环境不利于秋水仙碱的萃取。故选择pH=7.0进行实验。

2.2 样品分析

2.2.1 标准曲线

标准品溶液的制备及标准曲线的建立:取适量秋水仙碱对照品，加入超纯水配制0.2 mg/mL的对照品贮备液，精密吸取该贮备液，依次配制浓度为0.1，0.05，0.01，0.005，0.001 mg/mL的对照品溶液，分别吸取5 μL，按上述色谱条件进样，以峰面积积分值为纵坐标，秋水仙碱对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程:Y=15595.48828X+ 0.84979，R2=0.99996，线性范围:0.001～0.1 mg/ mL。此标准曲线用于粗提液中秋水仙碱含量及双水相萃取后秋水仙碱萃取率及富集倍数计算。

2.2.2 样品测定

用以上确定的最适双水相萃取条件对丽江山慈菇粗提液进行双水相萃取后，进HPLC检测秋水仙碱含量，HPLC色谱图见图7～10，检测结果见表2。

表2 样品检测结果Table 2 The determine results of sample

从图7～10及表2中可以看出，经过双水相萃取，丽江山慈菇中的秋水仙碱主要集中于上相(PEG相)，下相中仅存留很少量的秋水仙碱。萃取液经HPLC检测，上相中秋水仙碱浓度为0.7496 mg/ mL，富集倍数为6.84倍，萃取率为82.09%。通过以上实验结果可以得出，此方法用于丽江山慈菇粗提液中秋水仙碱的初步分离富集有效，为进一步提高萃取率，可考虑在下相中加入PEG进行二次萃取。秋水仙碱在双水相体系中的分配机理有待进一步研究。

3 结论

本文探讨了PGE-(NH4)2SO4双水相体系对秋水仙碱的萃取，对影响秋水仙碱萃取率的因素(PEG分子量、PEG的浓度、(NH4)2SO4的浓度和pH值)进行了考查研究，确定了最佳萃取条件:质量分数为8%的PEG6000和20%的(NH4)2SO4，pH=7.0对丽江山慈菇粗提液进行双水相萃取，萃取率为82.09%，富集倍数为6.84倍。本实验为生物碱类化合物萃取分离提供了一种有效方法。相比传统的液液萃取、固相萃取等方法，此方法具有简单、萃取条件温和、不使用有机溶剂，更加环保、可连续操作、安全方便等优点。

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Extraction the Colchicine of Iphigenia indica in Aqueous Two-phase System

SHI Yao1，2，YANG Ya-ling1*，LI Wan-yi2，LIU Mou-sheng11Faculty of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China;2Medical Plant Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kunming 650223，China

A new method to extract the colchicine of Iphigenia indica in aqueous two-phase system(ATPS)formed by macromolecular compound PEG6000 and(NH4)2SO4was investigated.The effect of the molecular weight of PEG，the concentration of PEG，the concentration of(NH4)2SO4and pH on phase behavior of the ATPS and extraction efficiencies of colchicines was investigated systematically.Determination the content of colchincine in the extraction phase combined with HPLC.The results showed that the best ATPS was composed of 8%PEG6000 and 20%(NH4)2SO4，pH 7.0.The extraction efficiency of colchicine of crude extract could reach to 82.09%，fold enrichment reach to 6.84.This method could be used to initial separate and enrichment the colchicine of Iphigenia indica，simple operation and friendly to the environment.

Iphigenia indica;colchicine;aqueous two-phase system;HPLC

1001-6880(2012)10-1412-05

2011-11-11 接受日期:2012-03-22

*通讯作者 Tel:86-013888316388;E-mail:yilyil8@163.com

R284.2

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