狭苞橐吾中几种倍半萜类化合物的活性筛选

柴 智，樊慧杰，王永辉，薛慧清

山西中医学院实验管理中心，太原030024

狭苞橐吾中几种倍半萜类化合物的活性筛选

柴 智，樊慧杰，王永辉，薛慧清*

山西中医学院实验管理中心，太原030024

本文对山西狭苞橐吾中倍半萜类化合物的生物学活性进行了筛选。用不同浓度的4种艾里莫芬烷型倍半萜干预携带有P53和SV40肿瘤病毒大T抗原基因的AH109菌液，采用酵母双杂交系统的β-半乳糖苷酶活力测定方法，分析了4种倍半萜对P53蛋白与SV40大T抗原之间相互作用力的影响。发现8β-methoxyeremophil-7 (11)-ene-12，8α(4β，6α)-diolide(1)和8β-hydroxyl-6β-angloxyeremophil-7(11)-ene-12，8α-olide-15-oic acid(2)对P53蛋白及SV40-大T抗原相互作用没有显著影响，但是中、高浓度的furanoeremophilan-4β，6α-olide(3)和低、中、高浓度的8β-hydroxyeremophil-7(11)-ene-12，8α(4β，6α)-diolide(4)对P53蛋白与SV40大T抗原之间相互作用有抑制效应。说明从山西狭苞橐吾中提取出的化合物3和4对酵母双杂交系统中的P53和SV40-大T抗原的相互作用有生物学抑制活性。

狭苞橐吾;倍半萜;活性筛选

菊科橐吾属植物约有130余种，分布于我国西北、西南、华北和东北［1］，其根、茎、叶皆可入药，有清热解毒、消炎杀菌、化痰止咳和活血止痛等功效，我国许多地区将多种该属植物的根和根茎作为“紫菀”的替代品使用［2］，习称为“山紫菀”或“川紫菀”等。故民间主要用于治疗痈肿、风湿感冒、咽喉炎、肺结核咯血、小便不利及跌打损伤等症［3］。另有研究报道，本属蓝灰组植物网脉橐吾、侧茎橐吾中的倍半萜成分具有抗肿瘤、抗菌等生物学活性［4］。山西有7种菊科橐吾属植物［5］，其中包括狭苞橐吾。本研究小组对采自山西关帝山的狭苞橐吾进行了较为系统的化学成分研究，从中分离鉴定出28个化合物，其中13个为倍半萜类化合物［6-8］。本文对分离得到的4个含量较高的艾里莫芬烷型倍半萜的生物学活性进行了研究，采用酵母双杂交系统的β-半乳糖苷酶活力测定方法，以P53蛋白与SV40大T抗原之间的相互作用作为药物分子靶标，测定4个倍半萜类化合物对它们之间相互作用的影响，初步对4个倍半萜进行活性筛选。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒和试剂

MATCHMAKER双杂交系统3(包括pGBKBT7质粒包含Trp营养选择和APR抗生素标记，pGBADT7质粒包含Leu营养选择和Kanr抗生素标记，pGBADT7-SV40，pGBKBT7-P53，pGBADT7-Lam质粒，酵母菌AH109)(美国Clontech公司);携带人P53蛋白与SV40大T抗原相互作用的阳性克隆菌株AH109(本实验室自制)。YPD培养基(美国Clontech公司);邻硝基苯-β-半乳吡喃糖苷(o-nitrophyl-β-D-galactopyranoside，ONPG;美国 Sigma公司);其余均为国产试剂。

1.1.2 阳性药物顺铂(香港Faulding公司)，临用前用无菌生理盐水配制为l mg/mL的工作液。

1.1.3 倍半萜样品

［9］，对4种倍半萜进行了分离，并分别鉴定为:8β-methoxyeremophil-7(11)-ene-12，8α(4β，6α)-diolide(1)、8β-hydroxyl-6β-angloxyeremophil-7 (11)-ene-12，8α-olide-15-oic acid(2)、furanoeremophilan-4β，6α-olide(3)、8β-hydroxyeremophil-7 (11)-ene-12，8α(4β，6α)-diolide(4)。实验时称取一定量的样品，溶于二甲亚砜(DMSO)中，浓度为10 mg/mL，4℃保存备用。

1.1.4 仪器

ESCO Opti-MAIR ACB-A型超净工作台(新加坡艺思高科技有限公司);HZQ-F160全温震荡培养箱(上海安亭科学仪器制造厂);721型紫外分光广度计(上海第三分析仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1 样品的毒性检测

分别将50、100、150 μL待测样品溶液加入5 mL含酵母菌AH109菌株的YPD培养基中，体积差用溶剂补齐;以加入150 μL YPD培养液，不加入待测样品溶液为空白对照组。30℃、180 rpm振摇过夜。经过16～18 h的培养，在波长600 nm处测定A值以判断四种倍半萜类化合物对酵母生长的影响，实验平行三次。

1.2.2 系统检测及样品的活性筛选

在SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His液体培养基中活化携带有 P53和 SV40肿瘤病毒大 T抗原基因的AH109菌株(空白对照组)，在SD/-Leu/-Trp液体培养基中活化携带有层粘连蛋白Lam和SV40肿瘤病毒大T抗原基因的AH109菌株(阴性对照组);将药品顺铂(阳性对照组)和4种倍半萜类化合物(实验组)分别按三个浓度接种于携带有P53和SV40肿瘤病毒大T抗原基因的AH109菌株的液体中，体积差用溶剂补齐，每个浓度接种三管(见表1)。30℃振摇(180 rpm)16～18 h后取出，以ONPG为反应底物分析检测β-半乳糖苷酶的活力。

表1 接种条件Table 1 Inoculation conditions

1.2.3 β-半乳糖苷酶测定及计算方法［10］

将菌液离心后，用Z-buffer清洗一次，再离心，弃上清，然后用0.3 mL Z-buffer重悬细胞。向1.5 mL微量离心管中加入0.1 mL菌液，在液氮中裂解2次以上，加入0.7 mL Z-buffer巯基乙醇、0.16 mL ONPG(4 mg/mL)，混匀后30℃保温记时至溶液变黄，加入0.4 mL 1 M Na2CO3，混匀，14，000 rpm离心10 min，取上清液，比色法测定A420值。

β-半乳糖苷酶单位数［11］=1000×A420/(t×V ×A600)。其中:

t=反应开始到溶液变黄的时间;V=0.1 mL×浓缩因子。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 系统检测

β-半乳糖甘酶活力(IU)在阴性对照组为1.10 ±0.23，低浓度阳性对照组为22.35±0.57，而空白对照组为41.35±0.68，表明作者构建的酵母双杂交系统工作正常，可以定量检测出目标蛋白之间存在的相互作用。

2.2 样品的毒性检测结果

将不同浓度的4种倍半萜样品加入含有AH109菌株的YPD培养基中，培养16～18 h，测定各培养基的A600nm值。4种倍半萜的不同浓度组与空白对照组相比，均无统计学差异，即四个倍半萜类化合物均未显示出对酵母生长有显著性影响作用，同时排除了溶剂DMSO对酵母生长的影响。样品可以用于后续活性筛选实验。

2.3 样品的活性筛选结果

30℃保温，180 rpm振摇过夜，在细胞生长16～18h后通过测定β-半乳糖苷酶活力反映酵母体内P53蛋白与SV40大T抗原之间相互作用力的大小，进而进行样品活性的筛选(见表2)。实验观察到化合物1和化合物2与空白对照组相比，对P53合SV40-大T抗原的相互作用没有显著性差异。化合物3在50 μL时对P53和SV40-大T抗原之间的相互作用无明显影响，在100 μL和150 μL时对两蛋白的相互作用有明显影响，但两个体积之间比较无显著性差异。化合物4在50、100、150 μL不同体积情况下，对两蛋白的相互作用均有明显抑制作用，抑制作用呈现增高趋势，但无统计学差异。

表2 不同样品对β-半乳糖苷酶活力的影响Table 2 Effects of differenrt samples on β-Galactose glucoside enzyme activity

3 讨论

橐吾属植物在我国分布广泛，我国是在80年代中期开始对其化学成分进行研究。为了增强疗效、减小毒性，本课题组前期分离纯化了其中的化学成分倍半萜，本实验为进一步对这类化合物进行活性筛选研究。

酵母双杂交系统是一种在酵母体内研究蛋白质-蛋白质之间相互作用的快速灵敏的方法［12］，其在小分子化合物药物筛选方面，具有巨大潜力。P53蛋白是一种抑癌基因产物，当P53蛋白与病毒癌蛋白SV40大T抗原之间相互作用时会导致其功能的丧失从而引起多种癌变的发生［13］，本课题选择携带人P53蛋白与SV40大T抗原为酵母双杂交系统的靶蛋白对，通过分析β-半乳糖苷酶活力来明确4种倍半萜对酵母体内P53蛋白与SV40大T抗原之间相互作用力的大小。

本课题应用酵母双杂交系统的β-半乳糖苷酶活力测定方法，研究来自于山西关帝山狭苞橐吾的4个倍半萜类化合物。结果发现中、高剂量的化合物3和低、中、高剂量的化合物4对于P53蛋白与SV40大T抗原之间的相互作用力有影响，分别在一定程度上降低这两个蛋白之间的相互作用力;其中，化合物4随着样品量得增加，对两蛋白相互作用的抑制作用呈轻微增高趋势。虽然不同剂量的化合物1和化合物2对P53和SV40-大T抗原之间的相互作用均没有显著影响，但不排除它们可以与加强或抑制作用的组分起协同作用。这些仍需要进一步的深入研究。本课题结果从分子水平阐明倍半萜的生物学活性，并为采自山西关帝山狭苞橐吾中提取的倍半萜类化合物的潜在抗肿瘤药物机理提供了一些启示。

参考文献

1 Editorial Board of Chinese Florae of the Chinese Academy of Sciences(中国科学院中国植物志编委会 ).Flora of China (中国植物志).Beijing:Science Press，1989.77(2):81-82.

2 Liu SJ(刘守金)，Qi HY(戚欢阳)，Qi H(齐晖)，et al.Species of Ligularia in the northwestern China and their medicinal uses.Chin J Chin Matet Med(中国中药杂志)，2006，31 (10):793-797.

3 Jiangsu New Medical College(江苏新医学院).Dictionary of Chinese Material Medic(中药大辞典).Beijing:People's Medical Publishing House，1977.2349-2350.

4 Zhao Y，Wang P，Hao XJ.Enantiomeric sesquiterpene lactones from Senecio tsoongianus.Chin Chem Lett，2002，13: 754-757.

5 Editorial Board of Florae of Chinese(山西植物志编委会). Flora of Shanxi(山西植物志).Beijing:Science and Technology Press，2003.511-512.

6 Xue HQ(薛慧清)，Xue HF(薛慧峰)，Wu B(吴彪)，et al.The Crystal Structure of 8β-Hydroxyeremophil-7(11)-ene-12，8α(4β，6α)-diolide.Chin J Chem Phys(中国化学物理学报)，2006，19:519-522.

7 Xue HQ，Ma XM，Xing XL，et al.Eremophilane sesquiterpene lactones from Ligularia intermedia Nakai.Chem Nat Compd，2007，43:746-748.

8 Xue HQ(薛慧清).Study on the chemical constituents of Ligularia intermedia，Ligularia Xanthotricha Ling and Gentianopsis paludosa(Hook.f.)Ma.Lanzhou:Lanzhou Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Sciences(中国科学院兰州化学物理研究所)，PhD.2006.

9Xue HQ(薛慧清)，Ma XM(马雪梅)，Wei XN(魏小宁)，et al.Study on chemical constiuents from Ligularia intermedia of Shanxi.Chin J Chin Mate Med(中国中药杂志)，2007，32:1044-1047.

10 Burke D，Dawson D，Stearns T.Methods in Yeast Genetics.Tsinghua University Publishing House，2002.123-127.

11 Estojak J，Brent R，Golemis EA.Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurement.Mol Cell Biol，1995，15:5820-5829.

12 Fields S，Song O.A novel genetic system to detect proteinprotein interactions.Nature，1989，340:245-246.

13 Cho Y，Gorina S，Jeffrey PD，et al.Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex:understanding tumorigenic mutations.Science，1994，265:346-355.

Activity Screening on Sesquiterpene Compounds from Ligularia intermedia Nakai of Shanxi

CHAI Zhi，FAN Hui-jie，WANG Yong-hui，XUE Hui-qing*
Shanxi College of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan 030024，China

To study the biological activity of sesquiterpene compounds from Ligularia intermedia Nakai of Shanxi.With different concentrations of four kinds of sesquiterpenes intervening AH109 bacteria solution which carries P53 and SV40 tumor virus large T-Antigen genes，we adopted yeast two-hybrid system method for determination of beta-galactose glucoside enzyme activity to analyze the interaction effects on P53 protein and SV40 large T-antigen by the four compounds.The results indicated that 8β-methoxyeremophil-7(11)-ene-12，8α(4β，6α)-diolide(1)and 8β-hydroxyl-6β-angloxyeremophil-7(11)-ene-12，8α-olide-15-oic acid(2)had no significant effects on the interaction between P53 protein and SV40-large T-antigen.However，medium and high concentrations of furanoeremophilan-4β，6α-olide(3)，low，medium and high concentration of 8β-hydroxyeremophil-7(11)-ene-12，8α(4β，6α)-diolide(4)had an inhibitory effects on the interaction between P53 protein and SV40 large T-antigen.It showed that compounds 3 and 4 which extracted from Ligularia intermedia Nakai of Shanxi had biological inhibitory activity effects on the interaction between P53 and SV40-large T-Antigen of the yeast two-hybrid system.

Ligularia intermedia;sesquiterpenes;activity screening

1001-6880(2012)10-1408-04

2011-12-31 接受日期:2012-03-22

山西省科技攻关项目(20080311052-1);山西省自然科学基金资助项目(2009011013-1)

*通讯作者 Tel:86-351-2272277;E-mail:xuehuiqing@sina.com

R284.2

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