药品微生物限度检查法中几种样品前处理方法的可行性研究

周 剑，李 霞（重庆市食品药品检验所，重庆 401121）

药品微生物限度检查法中几种样品前处理方法的可行性研究

周 剑＊，李 霞（重庆市食品药品检验所，重庆 401121）

目的：考察药品微生物限度检查法中几种样品前处理方法的可行性。方法：采用《中国药典》中提供的非水溶性供试品的萃取法以及具抑菌活性供试品的离心沉淀法对8种标准菌株进行回收率试验。结果：8种菌株采用萃取法进行前处理后，有3种菌株回收率约为100%，另外5种菌株的回收率约为70%；采用离心沉淀法前处理后，白色念珠菌回收率均低于30%，黑曲霉回收率约为30%，其余6种菌株，当样品中不含辅料或含有可溶性辅料时，对其回收率影响不大，当样品中含有不溶性辅料时，其回收率均低于70%。结论：在药品微生物限度检查法时建议根据不同样品的抑菌活性等选择性采用相应的前处理方法。

微生物限度检查；样品前处理方法；可行性

微生物限度检查目前在国外越来越受到重视，每版药典收载的品种也越来越多，如《美国药典》（USP）24版收载微生物限度品种（217个）较23版（150个）增加67个。2010年版《中国药典》对微生物限度检查法也进行了一定的改动，其中对样品的前处理方法作了较为详细的规定[1]。但由于某些供试品本身具有抗菌或抑菌活性，由此可影响检验结果的准确性。而通过供试品前处理，可以去除样品的抑菌活性从而更好地对该药品的细菌、霉菌、酵母菌以及相应控制菌进行检测，避免了因采用常规方法检测控制菌或菌落数时，由于样品的抑菌特性，而难以直接检出细菌从而得出“阴性”或计数偏低的“合格”结论的情况。对供试品所进行的前处理方法，对样品本身所含微生物是否有影响，目前还没有系统的试验数据去支持，为此，笔者特采用2010年版《中国药典》中针对非水溶性供试品的萃取法以及针对具抑菌活性供试品的低速离心沉淀法[1]对8种标准菌株进行了回收率试验，从而为药品微生物限度检查法中几种样品前处理方法的应用提供依据。

1 仪器与材料

离心机、生化培养箱（重庆永生实验仪器有限公司）。

十四烷酸异丙酯（批号：20091002）、淀粉（批号：20091221）、微晶纤维素（批号：20091103）、蔗糖（批号：20091028）均由国药集团化学试剂有限公司提供。

试验菌：金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、生孢梭菌[CMCC（B）64941]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、乙型副伤寒沙门菌[CMCC（B）50094]、黑曲霉[CMCC（F）98003]均由中国食品药品检定研究院提供。

2 方法与结果

2.1 菌悬液制备

接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24h；接种白色念珠菌和黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁培养基中，白色念珠菌23～28℃培养24～48h，黑曲霉23～28℃培养5～7d。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌（或孢子）数为5000～10000cfu的菌悬液。

2.2 萃取法处理后的菌回收率试验

取无菌十四烷酸异丙酯20mL加入5000～10000cfu的试验菌，充分振摇，然后加入45℃的pH 7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（以下简称缓冲液）100mL，振摇5～10min，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为供试液。取供试液1mL分别注入平皿中，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。另取上述试验菌，直接加入缓冲液100mL作为对照溶液，测定所加的试验菌数。上述试验平行进行3次，并分别计算各试验菌每次试验的回收率（萃取处理后菌落数/对照溶液菌落数×100%），结果见表1。

表1结果显示，萃取法处理对白色念珠菌、乙型副伤寒沙门菌、黑曲霉回收影响较小（回收率可达100%左右）；对其余5种菌回收影响较大（回收率只能达到70%左右），不能完全萃取。

2.3 离心沉淀法处理后的菌回收率试验

2.3.1 不加辅料的离心沉淀法处理后的菌回收率试验。取缓冲液10mL，加入500～1000cfu的试验菌，500r·min－1离心5min，取全部上清液，补液至10mL，作为供试液。取供试液1mL分别注入平皿中，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。另取缓冲液10mL，加入上述试验菌，摇匀后直接作为对照溶液，测定所加的试验菌数。上述试验平行进行3次，并分别计算各试验菌每次试验的回收率（离心沉淀处理后菌落数/对照溶液菌落数×100%），结果见表2。

表1 萃取法处理后的菌回收率Tab 1 Results of bacteria recovery rate after extraction

表2 不加辅料的供试液离心沉淀法处理后的菌回收率Tab 2Results of bacteria recovery rate of test solution without excipient after centrifugal precipitation

由表2结果显示，离心沉淀法处理会造成白色念珠菌、黑曲霉大量被处理掉，回收率均远低于70%；而对其余6种菌回收影响较小。

因采用不加辅料的离心沉淀法处理时对上清液没有明确的界定，在提取过程中易出现偏差，故另对白色念珠菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及铜绿假单胞菌又重复进行了3次回收率试验。测得其回收率分别为白色念珠菌：18%、19%、18%，平均值18%；大肠埃希菌：92%、89%、97%，平均值93%；金黄色葡萄球菌：74%、73%、69%，平均值72%；枯草芽孢杆菌：91%、88%、88%，平均值89%；铜绿假单胞菌：94%、89%、93%，平均值92%。与前面试验结果基本一致，进一步验证了试验的重复性较好。

2.3.2 加辅料的离心沉淀法处理后的菌回收率试验。由于口服的固体制剂中除主药外，实际还含有大量的辅料，这些辅料一般难溶于水，故进行微生物限度检查时，样品中实际是含有大量不溶性物质的。为了考察这些辅料对试验菌回收的影响，特模拟样品的实际状态，操作时加入一定的辅料后作进一步试验，考察辅料对试验菌是否有吸附或携带作用。经对常用处方进行分析，初步拟订对处方中所占比例较大的淀粉、微晶纤维素和蔗糖等3个最常见的填充剂进行加入试验考察。

取淀粉、微晶纤维素和蔗糖各10g，分别加入缓冲液至100mL，混匀，作为1∶10的供试原液。取此原液10mL，加入500～1000cfu的试验菌，以500r·min－1离心5min；取全部上清液，补液至10mL，作为供试液（1∶10）。取供试液1mL分别注入平皿中，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。另取供试原液10mL，加入上述试验菌，摇匀后直接作为对照溶液，测定所加的试验菌数。上述试验平行进行3次，分别计算各试验菌每次试验的回收率（离心沉淀处理后菌落数/对照溶液菌落数×100%）以及平均回收率，结果见表3。

表3 含不同辅料的供试液采用离心沉淀法处理后的菌平均回收率（%%）Tab 3 Results of average bacteria recovery rate of test solution with different excipients after centrifugal precipitation（%%）

由表3结果显示，加入蔗糖对具抑菌活性供试品如采用离心沉淀法进行前处理，白色念珠菌、黑曲霉无论在含淀粉类、微晶纤微素类、蔗糖类或不含辅料时，其回收率均远低于70%；供试品中如含有不溶性的辅料如淀粉或微晶纤微素，试验菌中除铜绿假单胞菌的回收率略高于70%以外，其余7种菌株的回收率均未达到70%；供试品中如含有可溶性的辅料如蔗糖时，8种菌株的回收率反而有所升高。

3 讨论

（1）由于微生物基本上是存在于水相中的，理论上说，油相中的微生物采用萃取法是可以提取出来的，但实际上，萃取法很难达到100%的回收[2]。从上述试验就可以看出，8种试验菌，除3种菌萃取完全外，其余5种菌的回收率都只有70%，如果按《中国药典》标准回收率的低限限度70%计算，采用萃取法进行前处理后的菌实际回收率均约为50%左右。

（2）采用离心沉淀法进行前处理，由于存在一个沉降系数问题，而沉降系数又与菌的形态、大小等有关，因而，不同种类的菌株离心后所得回收率存在较大的差异，如白色念珠菌和黑曲霉采用此处理方法就基本上大部分被处理掉了。同时在进行离心试验时，样品里的不溶性物质对样品中所含的微生物还具有一定的携带作用，尤其当制剂中含有不溶性辅料时，其携带作用更强，因此，试验中应谨慎选择离心沉淀法进行前处理[3]。实际工作中，有些含不溶性成分的药品目前因无其他有效的方法消除抑菌活性而不得不采用离心沉淀法时，由于一般药品都对真菌类微生物无抑菌活性，可以选择采用离心沉淀法进行细菌数和控制菌的检查，同时结合常规方法进行霉菌及酵母菌等真菌类微生物的检查。

本试验结果显示，如采用萃取法和离心沉淀法对供试品进行前处理，前处理过程对样品本身所含的微生物实际是有一定影响的，故进行样品前处理时，应该考虑不同样品的抑菌活性和样品本身的性状，选择适宜的前处理方法，其所得试验结果才能更为真实地反映样品本身实际所含的微生物。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：附录ⅪJ.

[2] 杨 洁，严建国.微生物限度检查中非水溶性液体制剂供试液的制备方法[J].中国药业，2004，13（1）：54.

[3] 袁林娜，宋 勤.微生物限度检查法中低速离心法回收细菌、真菌试验方法的研究[J].药物分析杂志，2007，27（10）：1620.

Feasibility of Pretreatment Methods of Samples in the Microbial Limit Test

ZHOU Jian，LI Xia（Chongqing Institute for Food and Drug Control，Chongqing 401121，China）

OBJECTIVE：To study the feasibility of pretreatment methods of samples in the microbial limit test.METHODS：8kinds of standard strains were adopted for recovery test by extraction method for non-water soluble sample and by centrifugal precipitation method for test sample with anti-bacterial activity according to Chinese Pharmacopoeia.RESULTS：After extraction，the recovery rate of 3kinds of strains were found to be about 100%and that of other 5strains about 70%.After centrifugal precipitation，the recovery rate of Candida albicans was found to be less than 30%and Aspergillus niger was found about 30%.For other 6kinds of strains，the recoveries would hardly be influenced if there was no excipient or dissoluble excipient in the sample；but that would be less than 70%if there was insoluble excipient in samples.CONCLUSION：Pretreatment methods in the microbial limit test should be applied selectively according to the anti-bacterial activity of samples.

Microbial limit test；Pretreatment methods of samples；Feasibility

R927.1

A

1001-0408（2012）33-3136-02

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2012.33.25

＊工程师。研究方向：药品、食品及医疗器械微生物检查。电话：023-86072731。E-mail：zhoujian_1980101@163.com

2011-09-07

2011-10-16）